鋅轉(zhuǎn)運(yùn)體8多克隆抗體的制備及功能初步研究.pdf

1、一、背景
　　 糖尿病以胰島素分泌的絕對缺乏或外周組織對胰島素的敏感性降低為特點(diǎn)。來自于基因和環(huán)境的危險因素在糖尿病的發(fā)病過程中起了重要作用。自從1934年發(fā)現(xiàn)鋅是胰島素晶體的組成成分以來，鋅與糖尿病間關(guān)系的研究備受關(guān)注。許多研究試圖通過闡明鋅在糖尿病中的作用，以進(jìn)一步揭示糖尿病的發(fā)病機(jī)制并開發(fā)新的治療藥物。在人體各種組織器官中，胰島中鋅的含量最高，并且有研究證實胰島中鋅含量減少與糖尿病的發(fā)病密切相關(guān)。
　　 既往研究表

2、明，有兩個家族參與細(xì)胞內(nèi)鋅水平的調(diào)節(jié)。一個是ZnT(鋅轉(zhuǎn)運(yùn)體)家族，由基因SLC30A編碼，它通過使胞漿內(nèi)的鋅出胞或進(jìn)入細(xì)胞器而降低胞漿內(nèi)鋅的濃度。另一個是ZIP(鋅結(jié)合蛋白)家族，由基因SLC39A編碼，它的作用是使細(xì)胞外的鋅進(jìn)入胞內(nèi)或者使細(xì)胞器中的鋅轉(zhuǎn)移到胞漿而提高胞漿中鋅濃度。到目前為止，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)10個ZnT家族成員和15個ZIP家族成員。
　　 鋅轉(zhuǎn)運(yùn)體8(zinc transporter8，ZnT8)是ZnT家族成員之

3、一，它被認(rèn)為是胰島β細(xì)胞特異的鋅轉(zhuǎn)運(yùn)體。近期的研究表明ZnT8還表達(dá)于脂肪組織、外周血淋巴細(xì)胞、甲狀腺及腎上腺。多個研究表明ZnT8的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)rs132266634與2型糖尿病(type2 diabetes，T2DM)關(guān)聯(lián)。此SNP rs132266634的危險堿基與靜脈糖耐量試驗中胰島素分泌減少關(guān)聯(lián)；與胰島素原向胰島素的轉(zhuǎn)化過程障礙關(guān)聯(lián)；與空腹血糖的升高關(guān)聯(lián)

4、。因此，ZnT8可作為T2DM的基因標(biāo)志。
　　 除此之外，近來有研究發(fā)現(xiàn)ZnT8也是1型糖尿病的自身抗原之一。有關(guān)于ZnT8的SNPrs132266634與1型糖尿病關(guān)聯(lián)的報道。進(jìn)一步的研究證實利用shRNA下調(diào)胰島13細(xì)胞中ZnT8的表達(dá)后，β細(xì)胞中胰島素的含量降低并且葡萄糖刺激的胰島素分泌(glucose-stimulated insulin secretion，GSIS)減少。此外ZnT8基因敲除小鼠表現(xiàn)為血漿胰島素降低

5、及GSIS減少，而過表達(dá)ZnT8的INS-1(胰島素瘤細(xì)胞系)細(xì)胞中GSIS增加。
　　 先前的研究表明ZnT8可能是調(diào)節(jié)胰島素分泌的一個關(guān)鍵因子，并且可能成為治療糖尿病的藥物靶標(biāo)。除胰腺之外，脂肪組織是另一個表達(dá)ZnT8的組織。脂肪組織中瘦素的表達(dá)隨著其中鋅含量的增加而增加，反之亦然。瘦素是脂肪細(xì)胞分泌的一種激素，它在機(jī)體攝食和能量代謝的調(diào)節(jié)中發(fā)揮了重要作用。
　　 胰高血糖素樣肽-1(glucagon like pe

6、ptide-1，GLP-1)具有促胰島素分泌、抑制胰高血糖素分泌、刺激胰島β細(xì)胞的增殖和分化、抑制β細(xì)胞凋亡、抑制胃排空等作用，近年來成為治療糖尿病藥物研究中的熱點(diǎn)。Magnusson N等的研究表明GLP-1可以上調(diào)INS-1細(xì)胞中ZnT8 mRNA的表達(dá)，但GLP-1在體內(nèi)如何影響ZnT8表達(dá)仍不明了。天然的GLP-1在體內(nèi)很快被二肽基肽酶-Ⅳ(dipeptidylpeptidaseⅣ，DPP-Ⅳ)降解，它的半衰期只有幾分鐘。Exe

7、ndin-4是GLP-1類似物，它在體內(nèi)穩(wěn)定性較好，通過與GLP-1受體結(jié)合而發(fā)揮降血糖作用。
　　 目前ZnT8在T2DM胰腺和脂肪組織中的表達(dá)情況如何還沒有報道。ZnT8在T2DM發(fā)病過程中發(fā)揮何等作用等還有待進(jìn)一步研究。
　　 二、目的：
　　 本研究的目的在于探討ZnT8在T2DM中的作用，及其可能的作用機(jī)制。利用分子克隆技術(shù)構(gòu)建ZnT8原核表達(dá)載體，對ZnT8蛋白進(jìn)行原核表達(dá)及純化。以所純化的蛋白免疫新

8、西蘭兔得到ZnT8多克隆抗體，并對抗體進(jìn)行純化。選擇db/db小鼠(T2DM模型小鼠)作為研究對象，從mRNA水平及蛋白水平檢測ZnT8在胰腺和脂肪組織的表達(dá)情況。同時選擇Exendin-4進(jìn)行干預(yù)(db/db小鼠腹腔注射Exendin-4)，觀察干預(yù)后ZnT8在胰腺和脂肪組織中表達(dá)的變化。
　　 三、方法：
　　 1.依據(jù)ZnT8羧基端(ZnT8-C，268-369位氨基酸)基因序列(GenBank NO：NM_173

9、851.2)分別設(shè)計帶有BamHI和NotI酶切位點(diǎn)的引物，以Chimienti教授惠贈p-ZnT8載體為模板，利用PCR擴(kuò)增ZnT8-C片段，并克隆至原核表達(dá)載體pET32a，經(jīng)測序正確后，將之轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)pLysS，誘導(dǎo)表達(dá)、Ni2+-NTA層析純化，并用His抗體鑒定的，獲得純化ZnT8-C重組蛋白。
　　 將純化的ZnT8-C重組蛋白與弗氏佐劑乳化，將其作為抗原免疫新西蘭兔，獲得兔抗血清，經(jīng)飽和硫酸銨

10、純化，獲得初步純化的兔抗ZnT8多克隆抗體，通過間接ELISA檢測多克隆抗體效價，Western blotting及免疫組化方法初步檢測其活性。
　　 2.提取db/db小鼠胰腺及脂肪組織的總RNA及總蛋白，應(yīng)用real-time PCR技術(shù)及Western blotting技術(shù)從核酸水平及蛋白水平檢測ZnT8的表達(dá)情況。Exendin-4給藥干預(yù)后觀察db/db小鼠胰腺及脂肪組織中ZnT8的表達(dá)情況。
　　 四、結(jié)果：

11、
　　 1.(1)成功擴(kuò)增出ZnT8-C的cDNA，經(jīng)序列比對，與GenBank上登錄的編碼ZnT8的羧基端cDNA序列完全匹配。(2)成功構(gòu)建了重組原核表達(dá)質(zhì)粒pET32a-ZnT8-C并在大腸桿菌BL21(DE3)plysS中獲得可溶性表達(dá)，分子量約30kDa，經(jīng)Ni2+-NTA層析純化，Western blotting鑒定為所需ZnT8-C目的蛋白。(3)獲得純化的ZnT8-C重組蛋白，并用其免疫新西蘭兔，得到兔抗ZnT8

12、多克隆抗體。以重組蛋白為抗原，用間接ELISA檢測ZnT8抗血清的效價在1:3200-1:6400。免疫印跡分析：ZnT8抗血清在分子量約30kd處與相應(yīng)的原核表達(dá)蛋白呈現(xiàn)特異性結(jié)合條帶，表明所制備的多克隆抗體具有較好的免疫學(xué)活性。
　　 2.(1)db/db小鼠胰腺組織中ZnT8的核酸和蛋白表達(dá)與雜合子的對照小鼠相比顯著降低。db/db小鼠睪丸脂肪和中心脂肪組織中ZnT8的核酸和蛋白表達(dá)與對照小鼠相比也顯著降低。(2)Exen

13、din-4給藥后db/db小鼠胰腺組織中ZnT8的核酸和蛋白表達(dá)與對照組相比顯著升高，而脂肪組織中ZnT8的核酸和蛋白表達(dá)與對照組相比沒有顯著差異。
　　 五、結(jié)論：
　　 本研究主要結(jié)論：
　　 1.成功制備了具有較好活性的ZnT8多克隆抗體。
　　 2.db/db小鼠胰腺和脂肪組織中ZnT8的表達(dá)較對照組降低，提示ZnT8可能參與了T2DM的發(fā)病及疾病的進(jìn)展；Exendin-4給藥可使db/db小鼠胰