鮑鐵蛋白、血藍蛋白原核表達及多克隆抗體制備、純化.pdf

1、鐵蛋白和血藍蛋白都是含有金屬離子的多功能蛋白，能直接或者間接的參與生物體內(nèi)重金屬離子的脫毒作用，并參與生物體多種生理生化的反應以及各種金屬蛋白和酶類的合成。當生物體遭受病原微生物感染時，鐵蛋白和血藍蛋白在生物體的表達量，都有上調(diào)的趨勢，可見與機體的免疫密切相關(guān)。
　　 鐵蛋白是由蛋白外殼和鐵核中心組成的一個具有獨特籠狀類似于球狀病毒的結(jié)構(gòu)，其生物學基本功能是在生物體內(nèi)儲存和釋放鐵離子，有效調(diào)節(jié)細胞內(nèi)鐵離子濃度，維持鐵離子在細胞內(nèi)

2、的代謝平衡，避免機體內(nèi)產(chǎn)生鐵中毒。鮑的鐵蛋白與脊椎動物的鐵蛋白相似，具有兩個不同的多肽鏈亞基，分別為鐵蛋白亞基l(Abalone ferritin subunit l，AbFel)和鐵蛋白亞基2(Abalone ferritin subunit 2，AbFe2)。
　　 血藍蛋白是動物界中第二大類載氧蛋白，主要分布在軟體動物的腹足類、頭足類及節(jié)肢動物的甲殼類等的血淋巴細胞中。鮑血藍蛋白(Ablonehemocyanin，AbHc

3、)是由二十聚體形成的中凹圓柱型結(jié)構(gòu)，與單孔螺血藍蛋白結(jié)構(gòu)相似具有兩個不同的亞基AbHcl和AbHc2，每個亞基都有8個功能單位(Functionalunits)，分別命名為a～h，分子量約為400KDa。研究表明，a～h功能體之間的氨基酸序列的同源性超過45％，不同的功能體可能由同一蛋白分子進化而來。
　　 本研究選取鮑鐵蛋白兩個亞基AbFel、AbFe2的ORF序列和鮑血藍蛋白AbHcHl亞基中FU-d、FU-h功能單位部分序

4、列AbHc-d和AbHc-h，進行原核表達，以弗氏佐劑乳化目的蛋白，采取肌肉多點注射的方法免疫實驗兔；經(jīng)4～5次免疫之后，獲得分別抗AbFel、AbFe2、AbHcld和AbHclh的四個抗血清。經(jīng)Westernblot檢測表明，抗AbFel、AbHcld重組表達蛋白的抗體效價較低，而抗AbFe2和AbHclh的特異性比較好，AbFel的抗體能識別AbFe2蛋白；另外，AbHclh和AbHcld的各自抗體都能相互識別AbHclh和AbH

5、cld蛋白。為了進一步驗證抗體的識別的特異性，采用50％和33％飽和硫酸銨分級沉淀純化抗血清，并以宿主菌的丙酮提取物去除抗體與宿主菌交叉性反應的抗體本底。將經(jīng)飽和硫酸銨粗純化的抗體進行Westernblot，本底明顯降低，抗體損失較小，而以宿主菌丙酮提取物去除本底后，抗體效價大為降低。同時為了探討了抗體與抗原結(jié)合的最佳工作濃度以及在蛋白亞基之間的抗體識別的特異性，采用電洗脫的方法回收表達的目的蛋白，通過酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)篩選Ab

6、Hcld、AbHclh抗血清與抗原的最佳結(jié)合濃度，結(jié)果顯示抗血清最佳稀釋倍數(shù)為1000倍，抗原濃度分別4μg/mL、2μg/mL。在確定抗體與抗原最佳結(jié)合濃度的基礎(chǔ)上，進行這兩個蛋白與各自抗體的競爭性ELISA實驗，檢測抗體的特異性及非特異識別的程度。
　　 本研究通過制備鐵蛋白亞基AbFel、AbFe2和血藍蛋白AbHcHl亞基的FU-d、FU-h功能體的多克隆抗體，檢測蛋白多聚體亞基之間的識別特異性，為進一步驗證鮑宿主在病原