用于診斷四種禽呼吸道疫病病毒可視化芯片的構(gòu)建及初步應(yīng)用.pdf

1、禽流感、新城疫、雞傳染性支氣管炎和傳染性喉氣管炎是雞群常見的四種呼吸道疫病。它們的發(fā)病癥狀和剖解病理變化相似，病死率較高，給養(yǎng)雞業(yè)帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。因此，對于四種疫病的鑒別診斷對防控具有重要意義。本研究是在傳統(tǒng)基因芯片技術(shù)的基礎(chǔ)上結(jié)合不對稱PCR技術(shù)，將生物素標(biāo)記的不對稱PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與寡核苷酸芯片雜交，然后與辣根過氧化物酶(Horseradish Peroxidase，HRP)包被的鏈霉親和素反應(yīng)，用二氨基聯(lián)苯胺(Diaminobe

2、nzidine，DAB)對該雜交體系顯色后，陽性信號能夠以肉眼可見的棕色斑點(diǎn)呈現(xiàn)。該研究建立的可視化寡核苷酸基因芯片技術(shù)可以對禽流感、新城疫、雞傳染性支氣管炎和雞傳染性喉氣管炎進(jìn)行同時鑒別診斷，為雞呼吸道疫病的臨床診斷提供了新的技術(shù)。
　　1.AIV的NP基因重組質(zhì)粒的構(gòu)建及寡核苷酸探針的設(shè)計
　　根據(jù)Genbank中收錄的基因序列，對AIV的保守基因NP，設(shè)計一對特異性引物，目的片段的長度為272 bp。以分離株H9為材料

3、提取RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。然后以cDNA為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得NP基因擴(kuò)增產(chǎn)物。將所獲得的PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收后與pMD19-T載體連接，然后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α，經(jīng)PCR擴(kuò)增和核酸序列測定鑒定，成功克隆出AIV-NP基因的重組質(zhì)粒;同時成功復(fù)蘇本實(shí)驗(yàn)室前期保存的NDV的F基因、IBV的N基因和ILTV的TK基因的凍干重組質(zhì)粒菌。
　　以AIV-NP、NDV-F、IBV-N和ILTV-TK靶基因核酸序列片段的正義鏈為模板

4、，用Oligo7.0軟件設(shè)計兩條寡核昔酸探針，長度為40 bp左右，Tm值為80℃左右，探針經(jīng)BLAST分析，確定各探針的特異性良好。
　　2.AIV-NDV-IBV-ILTV共檢可視化芯片的構(gòu)建及條件優(yōu)化
　　基因芯片的制備:用微陣列芯片噴樣系統(tǒng)晶芯(@)SmartArrayerTM16在尼龍膜上噴制芯片。噴制前先將尼龍膜在超純水中浸泡30 min待干燥后，將寡核苷酸探針與點(diǎn)樣緩沖液充分混合，調(diào)整探針到合適濃度后，將探針點(diǎn)

5、制到芯片上，待探針完全固定后，在紫外燈下交聯(lián)30 min，然后將制備好的芯片在4℃下密封保存。
　　不對稱PCR擴(kuò)增技術(shù):優(yōu)化生物素標(biāo)記的上游引物與未標(biāo)記的下游引物的濃度比例，提高擴(kuò)增的循環(huán)次數(shù)，控制模板濃度，用高濃度的瓊脂糖凝膠在低電壓條件下檢測擴(kuò)增的單鏈情況。結(jié)果表明，在反應(yīng)體系中當(dāng)生物素標(biāo)記的上游引物與下游引物在10∶1時，所獲單鏈產(chǎn)物最多。
　　芯片制備與檢測技術(shù)條件的優(yōu)化:對芯片制備和芯片檢測技術(shù)中的各項(xiàng)檢測條件進(jìn)

6、行優(yōu)化。結(jié)果表明:當(dāng)噴樣次數(shù)為1次;探針濃度為25μM;雜交時間為1 h;雜交溫度為50℃;濃度為1.0mg/mL Streptavidin HRP Conjugate稀釋2000倍;DAB顯色時間為5 min時，芯片檢測技術(shù)的結(jié)果最佳，確立了共檢芯片技術(shù)檢測的標(biāo)準(zhǔn)條件。
　　3.AIV-NDV-IBV-ILTV可視化共檢可視化芯片的質(zhì)量評價
　　本研究對構(gòu)建的AIV-NDV-IBV-ILTV共檢可視化芯片進(jìn)行了特異性、敏感

7、性和保存期研究。結(jié)果表明，本研究所構(gòu)建的芯片特異性良好;敏感性試驗(yàn)結(jié)果顯示最低可檢測出靶基因濃度為1.0×10-5μg/μl;隨機(jī)抽取保存不同時間的3張芯片進(jìn)行檢測，結(jié)果該芯片在保存180 d時仍可檢測;采用本研究所構(gòu)建的可視化芯片技術(shù)和實(shí)驗(yàn)室常規(guī)的RT-PCR/PCR技術(shù)同時對采自川渝地區(qū)的96份臨床組織樣品進(jìn)行檢測，結(jié)果兩種方法的檢測結(jié)果符合率為100％。本研究構(gòu)建的AIV-NDV-IBV-ILTV共檢可視化芯片，為雞病診斷提供了新