人呼吸道合胞病毒裂解純化疫苗的初步研究.pdf

1、目的：采用成熟的病毒裂解純化疫苗制備技術(shù)，以人類呼吸道合胞病毒(human respiratory syncytial virus，HRSV)野毒株中能誘導(dǎo)保護(hù)性抗體的F蛋白和G蛋白為目標(biāo)蛋白，研究有效裂解HRSV和純化目標(biāo)蛋白的方案。為獲得免疫原性強(qiáng)、安全性高的HRSV裂解純化亞單位疫苗做前期基礎(chǔ)研究?！　》椒ǎ罕狙芯糠譃閮刹糠郑徊糠质峭ㄟ^(guò)SDS-PAGE蛋白電泳觀察Triton X—100、NP—40等幾種常見裂解劑，在時(shí)間、溫

2、度和濃度三種因素改變的情況下對(duì)HRSV裂解的效果，以篩選出針對(duì)目標(biāo)蛋白裂解效果較好的裂解方案，并對(duì)這些裂解方案裂解過(guò)的樣品進(jìn)行蛋白免疫印跡(Western—blot)實(shí)驗(yàn)和透射電鏡檢查。另一部分是以蔗糖密度梯度離心法對(duì)裂解后的樣品進(jìn)行目標(biāo)蛋白的純化。摸索這種方法下，針對(duì)目標(biāo)蛋白較佳的純化條件。繼而純化出一定量的目標(biāo)蛋白并免疫小鼠，一月后處死采血，再進(jìn)行中和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證我們純化出的目標(biāo)蛋白的免疫原性和檢測(cè)其抗體效價(jià)。 結(jié)果：4％的去氧

3、膽酸鈉37℃作用樣品2h、2％的NP—4037℃作用樣品2h及1％Triton X—100作用90min對(duì)HRSV的裂解效果較好，其中前兩者均可在電泳圖上找到63KD和32KD的目標(biāo)蛋白，且條帶清晰。1％Triton X—1004℃作用90min的HRSV樣品雖然未能在電泳圖上觀察到32KD的目標(biāo)蛋白，但63KD的目標(biāo)條帶清晰粗大，有利于此目標(biāo)條帶的純化。電鏡結(jié)果顯示它們均對(duì)HRSV進(jìn)行了有效的裂解。Western—blot實(shí)驗(yàn)均可識(shí)別

4、此三種裂解方案裂解后的樣品63KD處的蛋白條帶。在對(duì)兩個(gè)目標(biāo)蛋白的純化條件的摸索中，我們發(fā)現(xiàn)應(yīng)用梯度為10％、15％、20％、25％和50％的不連續(xù)蔗糖密度梯度離心法，4℃、40000rpm離心16h對(duì)63KD的目標(biāo)蛋白純化效果好，三種裂解方案裂解后的63KD的目標(biāo)蛋白在15％和20％兩個(gè)蔗糖梯度層均有層積，后續(xù)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及中和實(shí)驗(yàn)提示，在20％處的63KD的目標(biāo)蛋白具有一定的免疫原性，抗體效價(jià)的平均值為1：4。 結(jié)論：實(shí)驗(yàn)中，篩