豬呼吸道疾病綜合征的四種病原菌復(fù)合PCR方法建立與應(yīng)用.pdf

1、豬呼吸道疾病綜合征(PorcineRespiratoryDiseaseComplex，PRDC)是引起呼吸系統(tǒng)癥狀的一類重要綜合征的總稱，近些年來，隨著規(guī)模化養(yǎng)殖的迅速發(fā)展，臨床上出現(xiàn)了一種以呼吸道癥狀為主癥的豬病，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大損失。研究表明，豬肺炎支原體(Mycoplasmahyopneumoniae，Mhp)、豬鏈球菌(Streptococcussuis，SS)、副豬嗜血桿菌(Haemophilusparasuis，HPS)、豬

2、多殺性巴氏桿菌(Pasteurellamultocida，Pm)是引起PRDC常見病原菌。迄今，安徽地區(qū)豬群中Mhp、SS、HPS和Pm的流行情況還不完全清楚，同時(shí)此四種病原菌引起的臨床癥狀較為相似，故難以從臨床癥狀上對(duì)其診斷，不利于準(zhǔn)確快速鑒別診斷。鑒于此，在前期研究的基礎(chǔ)上，本研究旨在建立同步檢測(cè)Mhp、SS、HPS、Pm的四重PCR方法，為臨床快速鑒別鑒定及其流行病學(xué)調(diào)查研究提供技術(shù)手段。為此，本研究開展了以下兩方面的工作。

3、>　　 首先，建立了檢測(cè)Mhp的單一PCR方法并優(yōu)化可以同步檢測(cè)Mhp、SS、HPS、Pm四種病原菌的復(fù)合PCR方法。根據(jù)MhpP36基因序列，應(yīng)用軟件設(shè)計(jì)合成特異性引物。通過優(yōu)化確定了檢測(cè)Mhp單一PCR方法的最佳反應(yīng)體系和反應(yīng)條件。再通過序列分析、敏感性試驗(yàn)、特異性試驗(yàn)和重復(fù)性試驗(yàn)評(píng)估建立的單一PCR方法。在單一PCR的基礎(chǔ)上，首先尋找能檢測(cè)四種病原菌的相同退火溫度，然后采用正交設(shè)計(jì)優(yōu)化TaqDNA聚合酶、Mg2+、dNTPs和引

4、物，并對(duì)PCR發(fā)應(yīng)時(shí)間和循環(huán)數(shù)進(jìn)行摸索，確定了四重PCR方法的最佳反應(yīng)體系和反應(yīng)條件。
　　 然后，利用建立的四重PCR、單一PCR與常規(guī)細(xì)菌分離技術(shù)相結(jié)合的方法，對(duì)分別采自安徽地區(qū)臨床疑似PRDC發(fā)病豬、臨床發(fā)病非PRDC豬以及臨床假定健康豬進(jìn)行檢測(cè)，并進(jìn)行細(xì)菌分離。結(jié)果顯示，總共分離細(xì)菌27株，其中SS18株，HPS4株，Pm6株，Mhp未做分離。四重PCR方法檢測(cè)結(jié)果與單一PCR方法檢測(cè)結(jié)果差異不顯著(P>0.05)，且符

5、合率為91.0％。安徽各地區(qū)豬場(chǎng)HPS存在較高帶菌情況，SS存在較高感染，HPS與SS同時(shí)陽性率較高，為15.84％(35/221)，而四種同時(shí)陽性率為0％，且病原在分布上有區(qū)域差異性，不同生長(zhǎng)階段的豬群均可檢出。
　　 綜上所述，本研究建立的四重PCR方法可以在3h鑒別出Mhp、SS、HPS和Pm，且具有良好的特異性、靈敏性、穩(wěn)定性和重復(fù)性，以及具有簡(jiǎn)便、快速與經(jīng)濟(jì)的優(yōu)勢(shì)，實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，所建立的四重PCR方法可直接用于臨床