三種主要犬呼吸道病毒多重PCR方法的建立和應(yīng)用.pdf

1、犬類常見呼吸道疾病多發(fā)于春，秋，冬三季，夏季相對較少。臨床上犬呼吸道疾病主要由病毒引起，特別是犬瘟熱病毒(canine distemper virus，CDV)，犬副流感病毒（canine parainfluenza virus，CPIV）和犬腺病毒Ⅱ型(canine adenovirus type-2，CAV-2)。已有不少研究者從不同角度用PCR方法對其進行單一或與其他病毒聯(lián)合研究，本文主要針對此三種病毒建立多重PCR診斷方法。

2、r>　　 根據(jù)GeneBank上發(fā)布的CDV、CPIV和CAV-2完整的基因組，分別用NCBI的BLAST同源性分析對基因組進行保守性分析，獲得各自的保守區(qū)序列:CDV中F基因序列的470～1989bp、CPIV中N基因序列的0～1658bp和CAV-2中全序列的25635～26230bp。本文采用Trizol方法同時提取含CDV、CPIV和CAV-2的陽性樣本中的RNA和DNA，將RNA反轉(zhuǎn)錄成的cDNA與DNA等濃度等比例混合作為

3、PCR體系的陽性模板。根據(jù)病毒保守序列設(shè)計引物，通過實驗選擇最佳的引物組合對。將PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)程序進行優(yōu)化，建立同時擴增CDV(500bp)、CPIV(293bp)和CAV-2(655bp)的多重PCR方法。取臨床上PCR檢測為陽性的病料核酸進行敏感性試驗和特異性試驗，證明此方法在臨床檢測中具有高度特異性和敏感性。
　　 在臨床上隨機收集39例呼吸道病犬的47份病料，用本文建立的多重PCR方法進行檢測，得到CDV陽性率為2

4、0.5％，CPIV和CAV-2陽性率均為5.13％。對陽性病例樣本擴增產(chǎn)物測序，與設(shè)計引物所用的病毒保守序列對比分析。用t檢驗和fisher精確檢驗對CDV的PCR檢測與膠體金檢測進行統(tǒng)計分析，結(jié)果顯示PCR檢出率與膠體金檢出率具有顯著性差異，PCR檢出為CDV陽性病例的死亡率與膠體金檢測為CDV陽性病例的死亡率也具有顯著性差異。
　　 PCR方法是從核酸角度對病毒進行驗證，是近些年新出現(xiàn)適用于臨床的一種分子生物學技術(shù)，檢測效率