控制水稻粒型基因GLW2的功能驗證及調(diào)控機(jī)理.pdf

1、水稻是我國重要的糧食作物，其產(chǎn)量高低涉及糧食安全。水稻產(chǎn)量構(gòu)成要素主要包含有效穗數(shù)、穗粒數(shù)、粒重、結(jié)實率等，其中粒重主要是受粒型和灌漿影響。盡管已經(jīng)有一些粒型相關(guān)基因被報道，但其調(diào)控粒型的分子機(jī)制仍不十分清楚。本實驗室在育種過程中發(fā)現(xiàn)了一份育種中間材料307R，其主要特征為籽粒明顯增大，千粒重達(dá)64g。在前期的研究中，通過系統(tǒng)的遺傳分析確定307R中存在一個顯性主效基因調(diào)控籽粒粒型及粒重;構(gòu)建了以IR24，MH63和527R為背景高世代

2、回交的近等基因系;通過細(xì)胞學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)307R大粒性狀是由于細(xì)胞的增大和數(shù)量增加所致;同時通過構(gòu)建BC3F2群體及重組純合體分析將該基因定位于2號染色體長臂端15.3kb范圍內(nèi)，確定編碼生長發(fā)育調(diào)控因子家族蛋白OsGRF4為候選基因，并將該基因命名為GLW2(Grain Length and Width2)。本研究在上述基礎(chǔ)上對GLW2的功能進(jìn)行了驗證，并確定了該基因的上游調(diào)控因子和下游互作蛋白，基本明確了GLW2控制水稻粒型粒重的遺傳機(jī)

3、理，結(jié)果如下:
　　1、以2x35S為啟動子，對OsGRF4進(jìn)行過量表達(dá)。結(jié)果顯示，過表達(dá)陽性植株籽粒粒長、粒寬及千粒重均極顯著高于對照;細(xì)胞學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)陽性植株外稃表皮細(xì)胞明顯大于對照。利用CRISPR/Cas9技術(shù)對NIL-527R中OsGRF4進(jìn)行基因編輯，結(jié)果表明基因敲除植株籽粒粒長、粒寬及千粒重均極顯著低于對照;細(xì)胞學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，基因敲除植株外稃表皮細(xì)胞明顯小于對照。上述實驗表明，OsGRF4可以通過控制細(xì)胞大小調(diào)控

4、水稻籽粒粒長、粒寬及千粒重，OsGRF4即為調(diào)控307R籽粒粒型的主效基因GLW2。
　　2、亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示OsGRF4定位于細(xì)胞核;同時在酵母細(xì)胞中OsGRF4具有轉(zhuǎn)錄激活活性，其活性區(qū)域位于OsGRF4 C端，這與OsGRF4作為一個轉(zhuǎn)錄因子生化功能相符合。
　　3、分析發(fā)現(xiàn)GLW2含有與OsmiR396互補(bǔ)的序列，且大?；蛳鄬τ谛×；虻耐蛔兾稽c(diǎn)剛好位于OsmiR396與OsGRF4的預(yù)測的結(jié)合區(qū)域。同時原位雜交

5、顯示，OsmiR396c和OsGRF4均在在穎殼中表達(dá)。對307R穗發(fā)育的不同時期的各個主要組織中GLW2表達(dá)量進(jìn)行分析，相較于OsGRF4在日本晴中的表達(dá)模式，發(fā)現(xiàn)OsGRF4在日本晴穗發(fā)育過程中呈下降趨勢，而在307R中呈上升趨勢。OsmiR396c在日本晴穗發(fā)育過程中的表達(dá)模式剛好與OsGRF4互補(bǔ)，暗示OsGRF4的功能可能受OsmiR396c調(diào)控。
　　4、利用5‘-RACE(rapid-amplification of

6、 cDNA ends)技術(shù)，確定了OsmiR396c在日本晴幼穗中OsGRF4的剪切位點(diǎn)。在大粒材料307R中，OsmiR396c在該位點(diǎn)剪切效率只有正常材料的1/10左右。用不同背景的大?；蚪然蛳蹬c一些不育系雜交，其F1代中存在OsGRF4正常與突變兩種mRNA，通過對不同雜交組合F1代幼穗cDNA進(jìn)行測序及峰圖分析發(fā)現(xiàn)，正常OsGRF4 mRNA較大粒突變型mRNA出現(xiàn)了強(qiáng)烈的下調(diào)。該結(jié)果顯示OsGRF4是OsmiR396的直

7、接靶基因;OsGRF4與OsmiR396c結(jié)合位點(diǎn)兩個堿基的突變降低了OsmiR396c的剪切效率，致使OsmiR396c對OsGRF4調(diào)控作用嚴(yán)重減弱，從而導(dǎo)致307R的大粒表型。
　　5、對OsmiR396c過表達(dá)發(fā)現(xiàn)，陽性植株籽粒粒長和千粒重均極顯著低于對照;細(xì)胞學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)陽性植株外稃表皮細(xì)胞明顯小于對照。在不改變編碼氨基酸序列的條件下，通過定點(diǎn)突變OsGRF4的cDNA序列構(gòu)建2個mOsGRF4過表達(dá)載體。轉(zhuǎn)基因結(jié)

8、果顯示過表達(dá)抗OsmiR396c剪切的mOsGRF4陽性植株籽粒粒長、粒寬及千粒重均極顯著高于對照;細(xì)胞學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)陽性植株外稃表皮細(xì)胞明顯大于對照。上述結(jié)果表明OsmiR396c可以通過對OsGRF4的直接負(fù)調(diào)控影響水稻粒型粒重，而去除或抑制這一調(diào)控過程可以提高水稻粒重。
　　6、表達(dá)模式顯示OsGIF1是一個組成型表達(dá)的基因，但其表達(dá)主要集中在莖和穗中。實驗表明OsGIF1也定位于細(xì)胞核。利用酵母雙雜交技術(shù)和雙分子熒光互

9、補(bǔ)技術(shù)驗證了OsGRF4和OsGIF1能發(fā)生直接相互作用。
　　7、以2x35S為啟動子，對OsGIF1進(jìn)行過量表達(dá)。結(jié)果顯示，過表達(dá)陽性植株籽粒粒長、粒寬及千粒重均極顯著高于對照;細(xì)胞學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)陽性植株外稃表皮細(xì)胞明顯大于對照。
　　8、將近等基因系NIL-527R、NIL-MH63及對應(yīng)親本527R、MH63分別與不育系640A、106A進(jìn)行雜交配制雜種F1。產(chǎn)量性狀調(diào)查發(fā)現(xiàn)所有近等基因系組配后代株系的籽粒粒長、

10、粒寬、千粒重和穗長極顯著增加;其穗粒數(shù)和分蘗數(shù)無明顯變化;所有近等基因系組配雜交稻單株產(chǎn)量和單位面積產(chǎn)量均顯著增加，在不同親本雜交后代中GLW2的增產(chǎn)潛力有差異，其增產(chǎn)幅度在13.74％-28.00％之間。
　　9、根據(jù)上述實驗，我們明確了OsGRF4是控制水稻粒型粒重的關(guān)鍵基因，在該基因的上游，OsmiR396c可以對其進(jìn)行直接調(diào)控，而在下游，OsGRF4通過與具有多效性的OsGIF1基因直接互作來調(diào)控水稻粒型粒重，我們的結(jié)果建