柱型蘋果MdCoL基因表達特性分析及功能驗證.pdf

1、柱型蘋果（Columnar apple）樹體矮生，節(jié)間短，長分枝少，是蘋果育種的珍貴資源。挖掘柱型Co基因以及探索其調(diào)控機理，對揭示柱型蘋果柱型性狀的形成及選育柱型蘋果新品種具有重要意義。
　　通過精細做圖已經(jīng)將Co基因定位在基因組的第10條染色體上，克隆得到了部分柱型相關(guān)基因，但是柱型Co基因及其如何調(diào)控柱型形成機理仍不清楚。本文以‘Wijcik’嫩莖為材料，克隆得到柱型候選基因，命名為MdCoL，采用Real-time PCR

2、技術(shù)檢測MdCoL基因在4組柱型蘋果材料（21-C、30-C、77-C、Wi）和普通型蘋果（21-S、30-S、77-S、Mc）中不同時期芽的相對表達量；通過轉(zhuǎn)化‘本生’煙草，驗證MdCoL基因的功能；以4組柱型蘋果突變體為試材，對其葉片解剖結(jié)構(gòu)及光合特性的相關(guān)參數(shù)進行了觀察和測定，以比較柱型蘋果和普通型蘋果的差別。研究結(jié)果如下：
　　1、以‘Wijcik’嫩莖為材料，克隆得到柱型候選基因，命名為 MdCoL，開放閱讀框長度為10

3、32bp，推測的蛋白質(zhì)的分子量為38.34kD，編碼339個氨基酸，等電點（pI）為6.27。對柱型蘋果MdCoL蛋白進行二級結(jié)構(gòu)在線預(yù)測，MdCoL蛋白包含111個α-螺旋，占32.74％；135個無規(guī)則卷曲，占39.82%；73個延伸鏈，占21.53%。經(jīng)過氨基酸親水性分析表明，該蛋白的多數(shù)氨基酸為親水性氨基酸。
　　2、利用Real-time PCR分析了MdCoL基因在4組柱型蘋果及普通型蘋果的不同器官及不同發(fā)育時期的相對

4、表達量，結(jié)果表明：MdCoL基因在柱型蘋果中的芽和新梢中的表達量都明顯高于普通型蘋果中的表達量，且在新梢中的表達量都明顯低于在芽的表達量，此外，除30-C和30-S外，MdCoL在5月份芽的表達量高于另外兩個時期的芽。
　　3、將構(gòu)建好的pCAMBIA1300-MdCoL表達載體和pCAMBIA1300空載體利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤轉(zhuǎn)化法分別轉(zhuǎn)入‘本生’煙草，經(jīng)PCR檢測，獲得17株陽性鑒定的煙草植株。利用洋蔥表皮，瞬時表達 pCAM

5、BIA1300-MdCoL，觀察到 MdCoL基因定位于細胞膜和細胞核上。
　　4、以未轉(zhuǎn)基因煙草為對照，對轉(zhuǎn)基因煙草進行株高、節(jié)間、莖粗度、開花數(shù)、分枝數(shù)、葉綠素等生理指標測定及表型觀察。結(jié)果表明：未轉(zhuǎn)基因煙草在株高、節(jié)間上是轉(zhuǎn)基因煙草的2-3倍，差異顯著；轉(zhuǎn)基因煙草根系粗壯、較長且分支多，植株葉片濃綠且厚，節(jié)間短小，植株整體表現(xiàn)矮小、緊湊；未轉(zhuǎn)基因煙草根系短且分支少，葉片薄，節(jié)間長，植株整體表現(xiàn)細長；轉(zhuǎn)基因煙草在花的數(shù)量上和葉

6、綠素（SPAD）濃度是明顯高于對照煙草，對照組煙草分枝數(shù)略多于轉(zhuǎn)基因煙草。轉(zhuǎn)基因煙草與柱型蘋果“樹體矮生，長分枝少，節(jié)間短”的特性表現(xiàn)一致。
　　5、對轉(zhuǎn)基因煙草的赤霉素生物合成途徑、受體和DELLA蛋白相關(guān)基因的表達分析，結(jié)果表明：MdCoL基因上調(diào)了DELLA蛋白相關(guān)基因，從而抑制赤霉素反應(yīng)。
　　6、以四組柱型蘋果突變體為試材，對其葉片解剖結(jié)構(gòu)及光合特性的相關(guān)參數(shù)進行了觀察和測定，結(jié)果表明:四組材料中，每組的柱型蘋果葉

7、片顏色濃綠，葉片較大、其重量、厚度、葉綠素（SPAD）含量、柵欄組織厚度和柵海比均顯著大于普通型蘋果。普通型蘋果葉片中每層?xùn)艡诮M織細胞大小一致，且排列整齊緊密，而柱型蘋果柵欄組織細胞排列相對雜亂。在一天的光合日變化中，柱型和普通型蘋果的凈光合速率（Pn）、蒸騰速率（Tr）均高于普通型蘋果，二者均呈明顯的雙峰曲線，12:00出現(xiàn)明顯的光合午休現(xiàn)象。在固定 LED光源下，同組材料中柱型蘋果凈光合速率（Pn）高于普通型，分別是普通型的1.1-