水稻候選抗病基因文庫(kù)構(gòu)建及功能驗(yàn)證.pdf

1、本研究通過三種策略克隆水稻R基因，即采用候選R基因富集文庫(kù)克隆野生稻R基因、通過hpRNA介導(dǎo)的基因沉默突變體庫(kù)克隆R基因和利用野生稻馴化基因克隆R基因。一方面可以為植物基因克隆提供新方法，另一方面可以豐富目前栽培稻R基因的遺傳多樣性，為抗性育種奠定材料基礎(chǔ)。
　　 野生稻是栽培稻的野生近緣種，富含R基因，其基因組、基因表達(dá)和調(diào)控等接近栽培稻。挖掘野生稻新尺基因用于栽培稻育種，比利用其它物種的R基因更安全、可靠和便捷。通過采用R

2、ecA蛋白介導(dǎo)的文庫(kù)富集技術(shù)篩選野生稻液體基因組文庫(kù)，本研究構(gòu)建了庫(kù)容量分別為4608個(gè)的東鄉(xiāng)野生稻和16128個(gè)的小粒野生稻R基因富集文庫(kù)。經(jīng)菌落原位雜交篩選，獲得118個(gè)候選陽(yáng)性克隆，其中東鄉(xiāng)野生稻候選陽(yáng)性克隆17個(gè)，小粒野生稻候選陽(yáng)性克隆101個(gè)。通過指紋圖譜分析，去掉重復(fù)，最終共獲得80個(gè)候選陽(yáng)性克隆。末端測(cè)序結(jié)果表明:80個(gè)候選陽(yáng)性克隆中25個(gè)可以定位于粳稻相應(yīng)染色體區(qū)段，51個(gè)無法在栽培稻上定位。25個(gè)可以定位的陽(yáng)性克隆中1

3、5個(gè)可定位于粳稻R基因附近或R基因內(nèi)，可能為新的候選R基因。對(duì)獲得全序列的7個(gè)克隆進(jìn)行序列分析，結(jié)果表明其中5個(gè)含R基因的保守結(jié)構(gòu)域，推測(cè)可能存在新的R基因。將候選陽(yáng)性克隆轉(zhuǎn)化粳稻感病品種臺(tái)北309，共獲得1938個(gè)轉(zhuǎn)基因植株。分別對(duì)758份、1033份和994份轉(zhuǎn)基因材料進(jìn)行田間白葉枯病原菌接種鑒定，未發(fā)現(xiàn)有明顯抗性材料。在瀏陽(yáng)病圃對(duì)758份材料進(jìn)行稻瘟病自然發(fā)病鑒定，大部分植株高感而枯死，43份轉(zhuǎn)基因材料表現(xiàn)感病4-5級(jí)水平，鑒定為

4、中感;在吉首病圃對(duì)1033份轉(zhuǎn)基因材料進(jìn)行了稻瘟病自然發(fā)病鑒定，大部分植株高感而枯死，19份材料發(fā)病較輕，處于中感水平。將吉首發(fā)病較輕的19份材料和93份T1代材料進(jìn)行稻瘟病自然發(fā)病鑒定，吉首發(fā)病較輕的19份材料中6份材料表現(xiàn)感病4-5級(jí)水平，鑒定為中感;93份T1代鑒定材料中有9份材料發(fā)病較輕，處于2-3級(jí)感病水平，鑒定為中抗。用RB系列菌株對(duì)457份材料進(jìn)行人工接種鑒定，初步確定轉(zhuǎn)基因材料943對(duì)RB19有抗性。對(duì)994份轉(zhuǎn)基因材料

5、進(jìn)行了細(xì)菌性條斑病接種鑒定，初步確定轉(zhuǎn)基因材料341對(duì)菌株RS105有抗性。
　　 hpRNA介導(dǎo)的突變體庫(kù)可以克服現(xiàn)有突變體庫(kù)的缺點(diǎn)，在大規(guī)模功能基因組研究中具有廣闊的應(yīng)用前景。本研究通過轉(zhuǎn)化RMHR系統(tǒng)建立水稻hpRNA文庫(kù)，轉(zhuǎn)化臺(tái)北309創(chuàng)建RNAi突變體庫(kù)，獲得轉(zhuǎn)基因植株211株。通過對(duì)突變體庫(kù)突變表型篩選，獲得類病斑突變體R102，序列分析表明對(duì)應(yīng)基因與植物的自然防御有關(guān)。
　　 在進(jìn)化過程中，野生稻的許多優(yōu)良