水稻粒寬基因GS5的調(diào)控與分子機(jī)理研究.pdf

1、水稻是最重要的糧食作物之一，如何提高水稻產(chǎn)量一直是科學(xué)研究與育種研究長(zhǎng)期關(guān)注的重點(diǎn)。水稻產(chǎn)量由單位面積穗數(shù)、每穗實(shí)粒數(shù)和千粒重三個(gè)因素構(gòu)成，千粒重由穎殼的體積和胚乳發(fā)育狀況兩個(gè)因素決定，對(duì)穎殼形狀與體積的描述一般稱為粒形，包括粒長(zhǎng)、粒寬和粒厚，因此，粒形是重要的產(chǎn)量性狀之一。前人通過(guò)圖位克隆法分離到GS5，它是第五染色體上的一個(gè)正調(diào)控粒寬、粒重和灌漿速率的微效基因，窄粒等位基因GS5-H94與寬粒等位基因GS5-ZS97之間的差異主要是

2、啟動(dòng)子區(qū)存在的18個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)造成兩者表達(dá)水平的高低不同。提高GS5的表達(dá)量可以增加粒寬，因?yàn)镚S5影響了一系列細(xì)胞周期調(diào)控基因的表達(dá)，GS5表達(dá)量的提高可以促進(jìn)穎殼細(xì)胞分裂，增加穎殼細(xì)胞數(shù)目。本研究主要內(nèi)容包括：
　　⑴GS5在綠色組織中的表達(dá)水平遠(yuǎn)高于非綠色組織，在非綠色組織中表達(dá)量最高的是發(fā)育中的幼穗。在幼穗發(fā)育過(guò)程中寬粒等位基因GS5-ZS97的表達(dá)量高于窄粒等位基因GS5-H94，而在綠色組織中GS5-H94的表達(dá)量反而

3、更高，暗示GS5的表達(dá)受到至少兩種不同因素的調(diào)控。
　?、艷S5啟動(dòng)子的順式作用元件大部分是光響應(yīng)元件，兩個(gè)等位基因的多態(tài)性位點(diǎn)主要造成光響應(yīng)元件的數(shù)量不同，GS5-H94含有更多的光響應(yīng)元件。研究證實(shí)GS5的表達(dá)受光照誘導(dǎo)，并在一天中表現(xiàn)出節(jié)律性變化。GS5-H94受光照誘導(dǎo)后表達(dá)量的改變更為劇烈，因此，可以解釋GS5在綠色組織中高表達(dá)，且GS5-H94拘表達(dá)量高于GS5-ZS97。
　?、抢靡幌盗薪囟膛c定點(diǎn)誘變的啟動(dòng)子

4、-GUS(β-Glucuronidase)片段分析造成幼穗中表達(dá)量差異的關(guān)鍵位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)啟動(dòng)子-1139 bp至-931 bp（記為B區(qū)）對(duì)GS5的差異表達(dá)具有最關(guān)鍵的影響。比較GS5-H94、GS5-ZS97與來(lái)自寬粒品種中花11的第三種單倍型GS5-ZH11的啟動(dòng)子-1139 bp至-604 bp區(qū)段（B、C區(qū)），鑒定出GS5-H94特有的三個(gè)SNPs（SNP_-1109，SNP_-1032和SNP-825），將GS5-ZS97的SN

5、P_-1109和SNP_-1032誘變?yōu)镚S5-H94基因型可將其啟動(dòng)子強(qiáng)度降低到GS5-H94水平上。
　?、葐?dòng)子B區(qū)的SNP-1109和SNP-1032位于一個(gè)GA(Gibberellin)響應(yīng)元件側(cè)翼，C區(qū)的SNP-825造成兩個(gè)等位基因產(chǎn)生一個(gè)光響應(yīng)元件的差異。將GA響應(yīng)元件誘變?nèi)笔Ш?，啟?dòng)子強(qiáng)度上升，表明GA響應(yīng)元件的作用是抑制表達(dá);將光響應(yīng)元件誘變后，啟動(dòng)子強(qiáng)度下降，表明光響應(yīng)元件的作用是促進(jìn)表達(dá);在幼穗中，GA響應(yīng)

6、元件對(duì)啟動(dòng)子強(qiáng)度的影響更大。激素處理結(jié)果表明GS5的表達(dá)不受GA影響，但ABA(Abscisic Acid)對(duì)GS5-H94的表達(dá)有明顯的抑制作用，對(duì)GS5-ZS97的影響則不明顯，從而造成GS5-H94的表達(dá)量低于GS5-ZS97。
　　⑸GS5是一種絲氨酸羧肽酶類蛋白，GS5-H94和GS5-ZS97的蛋白質(zhì)功能沒(méi)有差異，表達(dá)量的提高都可以使粒寬增加。GS5是分泌性蛋白質(zhì)，定位于細(xì)胞表面，與細(xì)胞膜之間存在密切聯(lián)系。過(guò)量表達(dá)時(shí)有

7、相當(dāng)一部分GS5蛋白滯留在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中。
　　⑹酵母雙雜交篩選到GS5可與細(xì)胞膜蛋白OsBAK1-7（擬南芥BAK1(BRI1-Associatied Kinase1)的同源基因）的胞外LRR(Leucine-Rich Repeat)結(jié)構(gòu)域互作。如同擬南芥的報(bào)道，OsBAK1-7的LRR結(jié)構(gòu)域也可與OsMSBP1（擬南芥MSBP1(Membrane Steroid-Binding Protein1)的同源基因）互作，這種互作會(huì)促進(jìn)Os

8、BAK1-7的內(nèi)吞。本研究表明當(dāng)細(xì)胞表面存在大量的GS5蛋白時(shí)，GS5與OsBAK1-7的互作會(huì)競(jìng)爭(zhēng)性抑制后者與OsMSBP1的互作，從而阻止OsBAK1-7的內(nèi)吞。這種競(jìng)爭(zhēng)性互作可以在一定程度上解釋為什么GS5的表達(dá)水平與表型正相關(guān)。
　　⑺GS5的表達(dá)受到BR(Brassinosteroids)的抑制;擬南芥BR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的一個(gè)絲氨酸羧肽酶BRS1在水稻中的超表達(dá)也可使粒寬增加，且粒寬也與其表達(dá)水平正相關(guān);加上GS5與Os

9、BAK1-7的互作關(guān)系，暗示GS5很可能通過(guò)BR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑調(diào)控穎殼細(xì)胞分裂和粒寬。OsBAK1-7超表達(dá)后植株半矮，莖稈變細(xì)，缺失突變體株高增加，莖稈變粗，可能對(duì)水稻生長(zhǎng)具有一定的抑制作用，但粒形沒(méi)有變化;OsMSBP1在各個(gè)組織時(shí)期都有很高的表達(dá)，其缺失突變體成苗率極低，絕大部分在萌發(fā)后死亡，植株矮化、分蘗減少、粒形變小，表明它對(duì)水稻生長(zhǎng)有必不可缺的作用。這兩個(gè)基因在BR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的作用還需進(jìn)一步研究，目前的初步結(jié)果認(rèn)為它們對(duì)水稻生

10、長(zhǎng)的作用是相反的，GS5通過(guò)對(duì)它們互作平衡的調(diào)節(jié)實(shí)現(xiàn)對(duì)表型的控制。
　?、虒?duì)527份核心種質(zhì)材料和17份野生稻材料進(jìn)行GS5的比較測(cè)序，從ATG上游2 kb到3'-UTR共6.4 kb的區(qū)間內(nèi)鑒定出130個(gè)SNPs和27個(gè)InDels，其中70％以上的多態(tài)性位點(diǎn)分布在2 kb的啟動(dòng)子區(qū)。根據(jù)這些多態(tài)性位點(diǎn)可將GS5分成49個(gè)單倍型(Haplotype)，歸為12個(gè)單倍群(Haplogroup)。一共鑒定出10種完整形式的GS5蛋白

11、類型，它們之間只有少數(shù)氨基酸的差異，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)提前終止的類型，其中GS5-P2（即GS5-H94）是最古老的蛋白質(zhì)類型，GS5-P1（即GS5-ZS97）形成較晚。
　?、退拇髥伪度褐?，GS5-1型（即GS5-ZS97型）和GS5-2型（即GS5-H94型）主要分布在秈稻中，GS5-3型（即GS5-ZH11型）主要分布在粳稻中，GS5-4型主要分布在aus稻中。由于群體結(jié)構(gòu)的存在，只能比較秈稻中GS5-1型和GS5-2型材料的粒形差

12、異，為了剔除同一染色體上粒寬主效基因qSW5/GW5的效應(yīng)影響，對(duì)其基因型進(jìn)行鑒定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)相同qSWS/GW5基因型的材料中GS5-1型和GS5-2型材料的粒寬沒(méi)有顯著差異，表明GS5的微弱效應(yīng)在自然群體中被掩蓋了。
　?、卧诙i稻IndI亞群中檢測(cè)到GS5的Tajima's D值顯著小于0，π值非常低，且該亞群中絕大部分是GS5-1型材料，暗示形成較晚的GS5-1可能受到人工選擇，但其微弱的效應(yīng)似乎不太可能被人類發(fā)現(xiàn)和選擇。分析