以CotB為分子載體表面展示PEDV S蛋白抗原片段的枯草桿菌重組芽孢的研究.pdf

1、本研究將豬流行性腹瀉病毒(PEDV)S蛋白COE1保護性抗原片段與枯草桿菌芽孢衣殼蛋白CotB基因進行融合，通過同源雙交叉構建表面展示S蛋白COE1保護性抗原片段的枯草桿菌重組芽孢。以小鼠為動物模型，通過灌胃及拌料方式給予重組芽孢，觀察重組芽孢對小鼠的免疫反應及部分微生態(tài)益生效應，以期依靠枯草桿菌天然的益生作用結合PEDV保護性抗原表位刺激的特異性黏膜免疫反應，用于預防豬流性型腹瀉病以降低其對畜牧業(yè)帶來的影響。試驗內(nèi)容與結果如下:

2、>　　(1)本試驗參考PEDV S蛋白抗原表位現(xiàn)有研究，選擇PEDV S基因的保護性抗原片段(COE1)，通過枯草桿菌穿梭整合質粒pDG364分別將目的片段CotB、COE1依次連接到質粒pDG364多克隆位點，構建重組質粒pDG364-CotB-COE1。對重組質粒分別進行PCR、雙酶切及測序鑒定，結果表明CotB、COE1基因片段成功地載入質粒pDG364多克隆位點，成功構建重組質粒pDG364-CotB-COE1。
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3、)重組質粒pDG364與枯草桿菌染色體通過同源雙交叉，使得CotB-COE1重組于枯草桿菌染色體，構建重組枯草芽孢桿菌(PBE)。通過淀粉酶活性分析與PCR鑒定，結果表明CotB-COE1融合基序成功整合于枯草桿菌染色體;Western-blot分析結果在67.78kDa處獲得一條特異性蛋白條帶，表明融合基序CotB-COE1獲得了表達;使用生物素標記抗體進行免疫熒光顯微鏡觀察，重組芽孢具有特異性熒光信號，結果表明PEDVS蛋白的COE

4、1保護性抗原片段成功地在枯草桿菌芽孢表面獲得表達。
　　(3)選用ICR雌性小鼠120只，隨機平均分成5組，即枯草桿菌重組芽孢灌胃組(gb)、枯草桿菌重組芽孢拌料組(bb)、野生型枯草桿菌168芽孢灌胃組(g1)、野生型枯草桿菌168芽孢拌料組(b1)、PBS對照組(K)。g1與gb組小鼠每次每只灌服芽孢懸液100μl（芽孢量為1.0×1010CFU）;b1與bb組則以拌料飼喂的方式給予小鼠芽孢，飼料含芽孢量為1.0×106CFU

5、/g;K組為PBS對照組，僅飼喂基礎日糧。采集血液、小腸內(nèi)容物，測定血清中抗PEDV特異性IgG抗體水平及小腸內(nèi)容物中sIgA抗體水平。結果表明，重組芽孢灌胃或拌料組小鼠血清及小腸內(nèi)容物中均檢測到PEDV特異性抗體，且各組在21d后可檢測到明顯的抗體水平，第35d抗體水平達到最高峰，至49天仍能檢測到較高水平的抗體;重組芽孢灌胃或拌料組與野生型芽孢灌胃或拌料組、對照組抗體水平相比，差異極顯著(P＜0.01);另重組芽孢拌料組所誘導的血清

6、IgG與腸粘膜sIgA抗體水平均高于灌胃組，但差異不顯著(P＞0.05)。
　　(4)采用MTT法檢測脾細胞增殖及采用ELISA檢測IL-4、IFN-γ分泌情況。結果，各組間小鼠脾細胞增殖刺激指數(shù)(SI)差異不顯著(P＞0.05);重組芽孢灌胃組IL-4和IFN-γ水平極顯著高于野生型芽孢灌胃組、對照組(P＜0.01);重組芽孢拌料組IL-4和IFN-γ水平極顯著高于野生型芽孢拌料組和PBS對照組(P＜0.01)，重組芽孢拌料組I

7、L-4水平極顯著高于重組芽孢灌胃組(P＜0.01)，但重組芽孢灌胃組所分泌IFN-γ水平則略高于重組芽孢拌料組(P＞0.05)。
　　(5)對試驗49d小鼠盲腸內(nèi)容物進行活菌計數(shù)及PCR-DGGE分析。結果表明，枯草桿菌重組芽孢灌胃或拌料組較對照組增重顯著(p＜0.05)，其中灌胃組增重略低于拌料組，但各組間差異不顯著(p＞0.05);對照組盲腸內(nèi)容物中大腸桿菌數(shù)量較其它組高，灌胃、拌料重組與非重組芽孢組盲腸內(nèi)容物中乳酸桿菌數(shù)量則

8、明顯高于對照組;PCR-DGGE分析顯示飼喂枯草桿菌芽孢組小鼠盲腸內(nèi)菌群數(shù)量和密度均得到增加。各組間胸腺指數(shù)差異不顯著(p＞0.05)，重組芽孢組小鼠脾臟指數(shù)極顯著高于野生型芽孢組、對照組(p＜0.01);
　　綜上所述，本試驗成功地將豬流行性腹瀉病毒的S蛋白保護性抗原片段COE1整合于枯草芽孢桿菌基因組。經(jīng)免疫熒光顯微鏡觀察及Western-Blot鑒定枯草桿菌重組芽孢具有較好的免疫原性。動物試驗結果表明枯草桿菌重組芽孢可誘導小