枯草芽孢桿菌表面展示人生長激素及其口服功效評估.pdf

1、人生長激素(human growth hormone，hGH)是一種重要的非糖基化蛋白質(zhì)激素。它包含有191個氨基酸分子，由人腦垂體中的生長激素細(xì)胞進行合成、存儲和分泌，是人類出生后促生長的最主要激素和體內(nèi)代謝途徑的最重要調(diào)節(jié)因子。hGH生理功能主要包括:促進軟骨、骨和組織的生長;調(diào)節(jié)代謝作用，促進脂肪分解和蛋白質(zhì)合成;調(diào)節(jié)機體免疫，維持機體的正常運轉(zhuǎn)。天然人生長激素非常稀少，因此，采用基因工程方法大規(guī)模生產(chǎn)hGH對滿足臨床大量需求具有

2、重要的意義。目前，臨床上使用的hGH主要是采用以E.coli為宿主通過重組DNA技術(shù)制造的生長激素(簡稱rhGH)。然而，用大腸桿菌表達易形成包涵體，且需要通過變性、復(fù)性操作，工藝復(fù)雜，活性低，導(dǎo)致商品化產(chǎn)品rhGH產(chǎn)品成本非常昂貴。故而rhGH在醫(yī)學(xué)上雖然用途前景很廣，但當(dāng)前仍無法大范圍推廣應(yīng)用。
　　枯草芽孢桿菌是一種革蘭氏陽性非致病性的益生菌，當(dāng)它處于營養(yǎng)缺乏或其它環(huán)境脅迫的不良條件下能形成抗逆性的休眠體—芽孢。因為芽孢具有

3、強烈的抗逆性，能夠在極端的溫度、輻射和毒性化學(xué)物質(zhì)等不利的環(huán)境下長期存活。因此，芽孢成為在極端環(huán)境中運載外源蛋白或具有活性的生物大分子的有效載體。本研究的目的是通過枯草芽孢表面展示技術(shù)將hGH展示在芽孢表面，構(gòu)建具有營養(yǎng)功能的表面展示hGH蛋白的重組芽孢。本研究的主要內(nèi)容和結(jié)果如下:
　　(1)以攜帶人生長激素hgh基因的載體為模板和PCR擴增出人生長激素基因hgh的編碼序列，并進行測序和數(shù)據(jù)庫比對鑒定。
　　(2)將hgh

4、克隆到質(zhì)粒pET30a上，使hgh基因前端連接腸激酶位點基因，構(gòu)建中間橋梁質(zhì)粒pET30a-hGH。
　　(3)將帶有腸激酶位點hgh基因克隆到質(zhì)粒pJS700上，使其與枯草芽孢桿菌芽孢衣殼蛋白基因cotC融合，構(gòu)建融合表達CotC-hGH的整合型重組質(zhì)粒pJS700-hGH。
　　(4)用質(zhì)粒pJS700-hGH轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌感受態(tài)細(xì)胞，篩選得到重組菌株并誘導(dǎo)該菌株產(chǎn)生芽孢，Western blot和免疫熒光實驗進一

5、步鑒定hGH成功的展示在芽孢表面。
　　(5)用芽孢表面展示hGH的重組芽孢口添五齡家蠶六天后，分析家蠶的生理生化指標(biāo)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，口添芽孢的家蠶體重變化、蛹體重、體重轉(zhuǎn)換效率等顯著優(yōu)于對照。進一步取家蠶血液進行Western blot實驗，證實家蠶體內(nèi)產(chǎn)生的CotC-hGH融合蛋白被精確切除并加工成小肽hGH，并且hGH蛋白可以被消化吸收到家蠶血淋巴。
　　(6)進一步用重組芽孢表面展示hGH的芽孢小鼠口服實驗，持續(xù)灌胃42