過氧化氫誘導(dǎo)斜帶石斑魚肝細(xì)胞氧化損傷的轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究.pdf

1、1.H2O2誘導(dǎo)斜帶石斑魚肝細(xì)胞氧化損傷模型的建立
　　通過不同的過氧化氫培養(yǎng)濃度(0、100、200、400、600、800、1000μmol/L)和作用時間(2、4、6、8、12、24h)探索適宜的斜帶石斑魚肝細(xì)胞氧化損傷濃度和時間，以建立的斜帶石斑魚原代肝細(xì)胞氧化損傷模型，并檢測培養(yǎng)過程中肝細(xì)胞的數(shù)量和活性的變化。采用單因子完全隨機(jī)設(shè)計實驗，根據(jù)臺盼藍(lán)對死細(xì)胞拒染法利用血球計數(shù)板測定細(xì)胞活力及數(shù)量，并通過MTT法測定細(xì)胞存活

2、率。結(jié)果顯示，800μmol/L H2O2，作用8h，斜帶石斑魚肝細(xì)胞的存活率降低至61.98％。
　　2.H2O2對斜帶石斑魚原代肝細(xì)胞活性及功能的影響
　　本研究采用斜帶石斑魚原代肝細(xì)胞模型，主要探究過氧化氫對原代培養(yǎng)的肝細(xì)胞氧化損傷機(jī)制的影響。通過測定不同培養(yǎng)時間下過氧化氫不同作用濃度的肝細(xì)胞或培養(yǎng)上清液中的超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、脂質(zhì)過氧化物(LPO)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)、過氧化氫

3、酶(CAT)的變化，分析細(xì)胞生長代謝狀態(tài)。結(jié)果顯示，使用過氧化氫處理后其他各組與800μmol/L和1000μmol/L組相比顯著降低了CAT、GSH-PX和SOD活性，顯著升高LPO、MDA含量(P＜0.05），但是800和1000μmol/L組之間沒有顯著差異(P＞0.05)。結(jié)果發(fā)現(xiàn):H2O2過氧化氫作用時間為8h、作用濃度為800μmol/L，使斜帶石斑魚原代肝細(xì)胞產(chǎn)生了明顯的氧化應(yīng)激，該條件可作為建立斜帶石斑魚肝細(xì)胞氧化損傷模

4、型的適宜條件。
　　3.利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)研究過氧化氫對肝細(xì)胞差異表達(dá)影響
　　本研究以過氧化氫為刺激源誘導(dǎo)建立了斜帶石斑魚肝細(xì)胞氧化損傷模型，試驗基于RNA-Seq技術(shù)對正常處理組(L-15)和對照組(800μmol/L H2O2)的斜帶石斑魚肝細(xì)胞進(jìn)行測序，利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)深度分析細(xì)胞內(nèi)部基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控以及過氧化氫處理后細(xì)胞表型和功能的改變。結(jié)果顯示，通過轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，對83，802，103條原始reads的篩選和排

5、除，拼接獲得到了112，618條Unigenes，平均長度為957.45bp，N50為1，687bp。按照Blast等相關(guān)軟件，對數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)分析后，共得到功能注釋基因110，560個。依據(jù)GO富集分析發(fā)現(xiàn)，差異表達(dá)基因主要被集中在代謝通路、細(xì)胞過程、生物調(diào)控等通路中，在KEGGpathway富集分析中結(jié)果顯示，代謝通路涉及基因最多，有170個。兩種水平下（過氧化氫處理組和對照組）共差異表達(dá)的基因共2，570個，其中上調(diào)的基因1，520