丙泊酚抑制缺氧神經(jīng)元自噬的效應(yīng)及機制.pdf

1、目的:觀察丙泊酚是否通過Bcl2-Beclin1-PI3KclassⅢ信號通路抑制缺血缺氧觸發(fā)的神經(jīng)元自噬小體形成和自噬性細胞死亡。探討丙泊酚是否通過NF-κB/p53信號通路抑制腦缺血再灌注損傷觸發(fā)的自噬激活和細胞凋亡。
　　方法:通過氧糖剝奪（oxygenandglucosedeprivation，OGD）損傷的方法建立腦缺血再灌注(I/R)損傷的離體細胞模型，采用透射電子顯微鏡、MTT法、LDH法檢測丙泊酚，3-methyl

2、adenine(3-MA)、BafilomycinA1(Baf)對OGD損傷神經(jīng)元樣PC12細胞自噬小體形成及細胞存活率的影響。采用Western-Blot等技術(shù)，檢測丙泊酚，LY294002對OGD損傷神經(jīng)元樣PC12細胞自噬相關(guān)蛋白PI3KclassⅢ、Beclin1、Bcl2、microtubule-associatedproteinlightchain3(LC3)表達的影響。通過雙側(cè)頸總動脈結(jié)扎合并低血壓建立了腦缺血再灌注損傷的

3、在體動物模型，采用尼氏染色法，免疫組織化學法，透射電子顯微鏡及Western-Blot等技術(shù)分別檢測丙泊酚，3-MA對I/R損傷大鼠海馬組織錐體神經(jīng)元數(shù)目、LC3-Ⅱ陽性細胞數(shù)目、超微結(jié)構(gòu)改變及自噬相關(guān)蛋白PI3KclassⅢ、Beclin1、Bcl2、LC3表達的影響。采用雙側(cè)頸總動脈結(jié)扎合并低血壓制作大鼠腦I/R損傷的動物在體模型，采用尼氏染色法、免疫組織化學法，RT-PCR及Western-Blot等技術(shù)，檢測丙泊酚、3-MA、P

4、FT-α對I/R損傷的大鼠海馬組織神經(jīng)保護作用及對LC3蛋白表達的影響。采用RT-PCR及Western-Blot技術(shù)，檢測丙泊酚、PFT-α、SN50對凋亡相關(guān)蛋白p53、PUMA、Bax、Bcl2及自噬相關(guān)蛋白DRAM、LC3、Beclin1、CathepsinD、CathepsinB表達的影響。
　　結(jié)果:透射電子顯微鏡顯示，在OGD損傷的神經(jīng)元樣PC12細胞內(nèi)和缺血再灌注損傷的海馬錐體神經(jīng)元內(nèi)有大量的自噬小體和自噬溶酶體形

5、成(p＜0.01)。Western-Blot實驗結(jié)果表明，自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ、Beclin-1、PI3KclassⅢ也相應(yīng)明顯增加(p＜0.01)，但細胞保護蛋白Bcl-2表達明顯降低(p＜0.01)。I/R或OGD損傷觸發(fā)的自噬小體和自噬溶酶體的形成，Beclin-1、LC3-Ⅱ、PI3KclassⅢ等自噬小體相關(guān)蛋白表達上升以及Bcl-2表達下降可被丙泊酚和3-MA、Baf、LY294002等自噬特異抑制劑所阻斷(p＜0.01)

6、。此外，MTT和尼氏染色結(jié)果顯示，丙泊酚可顯著增加OGD損傷的神經(jīng)元樣PC12細胞和I/R損傷的海馬錐體神經(jīng)元存活率(p＜0.01)。丙泊酚、3-MA和PFT-α可明顯抑制I/R損傷觸發(fā)的LC3-Ⅱ、p53mRNA及蛋白水平的表達增高(p＜0.01)。Western-Blot結(jié)果顯示，丙泊酚、PFT-α、SN50可明顯抑制I/R損傷引起的自噬相關(guān)蛋白DRAM、Beclin1、LC3-Ⅱ、CathepsinD、CathepsinB和凋亡相

7、關(guān)蛋白p53、PUMA、Bax表達增高(p＜0.01)。丙泊酚、PFT-α、SN50還能顯著抑制I/R損傷誘導的凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2的表達降低(p＜0.01)。
　　結(jié)論:丙泊酚通過降低自噬相關(guān)蛋白PI3KclassⅢ、Beclin1表達和增加Bcl2的表達抑制缺血缺氧觸發(fā)的神經(jīng)元自噬小體形成及自噬性細胞死亡。腦缺血再灌注損傷可引起NF-κB依賴性的p53表達增多，NF-κB/p53介導的自噬和凋亡機制參與了腦缺血再灌注損傷引起