自噬在系統(tǒng)性炎癥所致黑質(zhì)多巴胺神經(jīng)元損傷中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、第一部分：系統(tǒng)性炎癥導(dǎo)致黑質(zhì)多巴胺神經(jīng)元慢性、進(jìn)行性缺失和α-synuclein病理性蓄積
　　目的：建立系統(tǒng)性炎癥誘導(dǎo)的PD小鼠模型，研究系統(tǒng)性炎癥對(duì)黑質(zhì)多巴胺神經(jīng)元的慢性損傷作用和α-synuclein降解的影響。
　　方法：選取3、16月齡C57BL雄性小鼠作為年輕和老齡小鼠，單次腹腔注射細(xì)菌脂多糖（LPS,5mg/kg），進(jìn)行爬桿試驗(yàn)和步距測(cè)試的運(yùn)動(dòng)功能檢測(cè)；免疫組化法觀察黑質(zhì)多巴胺神經(jīng)元數(shù)量、小膠質(zhì)細(xì)胞活化狀態(tài)變化

2、和IL-1β的陽(yáng)性表達(dá)，免疫印跡法檢測(cè)腹側(cè)中腦（黑質(zhì)）α-synuclein蛋白表達(dá)水平；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法檢測(cè)α-synuclein轉(zhuǎn)錄水平。
　　結(jié)果：與正常對(duì)照組比較，16月齡小鼠于LPS注射后4-5m開(kāi)始出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)功能障礙，隨時(shí)間延長(zhǎng)進(jìn)一步加劇，而3月齡組出現(xiàn)較晚，延遲至 LPS注射后7m才出現(xiàn)（*P<0.05）；LPS注射后1d-7m整個(gè)觀察期內(nèi)，兩個(gè)年齡組小鼠黑質(zhì)部位小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量明顯增加，同時(shí)IL-1β陽(yáng)性表達(dá)明顯增加，

3、16月齡組的變化更顯著；LPS注射后5m，16月齡組小鼠黑質(zhì)多巴胺神經(jīng)元數(shù)量出現(xiàn)減少（27%），7m時(shí)進(jìn)一步降低（41%），3月齡組延遲至 LPS注射后7m，開(kāi)始出現(xiàn)減少（22%）；LPS注射后1d-7m整個(gè)觀察期內(nèi)兩個(gè)年齡組小鼠腹側(cè)中腦（黑質(zhì)部位）α-synuclein蛋白表達(dá)水平均顯著增加（**P<0.01），同期α-synuclein轉(zhuǎn)錄水平無(wú)顯著變化。
　　結(jié)論：通過(guò)單次腹腔注射細(xì)菌脂多糖可成功建立PD模型，小鼠黑質(zhì)部位出

4、現(xiàn)持續(xù)性神經(jīng)炎癥，多巴胺神經(jīng)元慢性、進(jìn)行性缺失，以及α-synuclein長(zhǎng)期病理性蓄積。
　　第二部分：系統(tǒng)性炎癥導(dǎo)致中腦黑質(zhì)自噬活性改變和多巴胺神經(jīng)元自噬功能障礙
　　目的：利用第一部分建立的PD模型，研究PD發(fā)病過(guò)程中黑質(zhì)部位自噬活性變化。
　　方法：選取3、16月齡的C57BL雄性小鼠作為年輕和老齡小鼠，細(xì)菌脂多糖（LPS，5mg/kg）單次腹腔注射制作PD模型，免疫印跡法檢測(cè)腹側(cè)中腦（黑質(zhì)） LC3-Ⅱ、p6

5、2和HDAC6蛋白表達(dá)水平；透射電鏡觀察黑質(zhì)神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)，免疫熒光共聚焦技術(shù)觀察多巴胺神經(jīng)元內(nèi)LC3、p62的表達(dá)。離體實(shí)驗(yàn)中，以不同濃度TNF-a處理低分化PC12細(xì)胞，MTT方法檢測(cè)細(xì)胞存活率；免疫印跡法檢測(cè)LC3-Ⅱ、p62和 a-synuclein蛋白表達(dá)水平，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法檢測(cè) p62和 a-synuclein轉(zhuǎn)錄水平。
　　結(jié)果：與正常對(duì)照組比較，LPS注射后1d-7m兩個(gè)年齡組小鼠腹側(cè)中腦（黑質(zhì)）均出現(xiàn)p62蛋白

6、表達(dá)增加（**P<0.01）； LC3-Ⅱ和HDAC6蛋白表達(dá)量均出現(xiàn)先增加后減少的動(dòng)態(tài)變化（**P<0.01），與3月齡比較，16月齡組LC3-Ⅱ和HDAC6蛋白表達(dá)下降更早出現(xiàn)；與正常對(duì)照組比較，LPS注射后1d，黑質(zhì)神經(jīng)元內(nèi)可見(jiàn)雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬體；而且多巴胺神經(jīng)元出現(xiàn)LC3和p62的陽(yáng)性表達(dá)；離體實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，TNF-α呈濃度依賴性地降低PC12細(xì)胞存活率（**P<0.01）；TNF-α(50 ng/ml)處理24h，PC12細(xì)胞

7、內(nèi)α-synuclein、LC3-Ⅱ和 p62蛋白表達(dá)水平增加（*P<0.05），而α-synuclein和p62轉(zhuǎn)錄水平無(wú)顯著變化。
　　結(jié)論：?jiǎn)未胃骨蛔⑸浼?xì)菌脂多糖建立的PD模型中，黑質(zhì)部位自噬出現(xiàn)早期自噬激活、后期自噬活性下降的動(dòng)態(tài)變化；炎癥可導(dǎo)致多巴胺神經(jīng)元的自噬激活但自噬流不能完成；炎癥因子TNF-α能誘導(dǎo)多巴胺神經(jīng)細(xì)胞出現(xiàn)自噬功能障礙，引起α-synuclein降解障礙。
　　第三部分：米諾環(huán)素預(yù)處理能減輕系統(tǒng)性

8、炎癥所致中腦黑質(zhì)急性炎癥和自噬功能障礙
　　目的：研究米諾環(huán)素預(yù)處理對(duì)中腦黑質(zhì)部位急性炎癥和自噬活性的調(diào)節(jié)作用。
　　方法：3月齡C57BL雄性小鼠，米諾環(huán)素預(yù)給藥三天，最后一次注射1h后，腹腔注射脂多糖（LPS，5mg/kg），進(jìn)行爬桿試驗(yàn)和步距測(cè)試的運(yùn)動(dòng)功能檢測(cè)；免疫組化方法觀察黑質(zhì)小膠質(zhì)細(xì)胞的活化狀態(tài)、IL-1β的陽(yáng)性表達(dá)；酶聯(lián)免疫吸附方法檢測(cè)TNF-α水平；免疫印跡法檢測(cè)黑質(zhì)部位LC3-Ⅱ、HDAC6、p62和α-s

9、ynuclein蛋白表達(dá)水平；免疫熒光共聚焦技術(shù)觀察多巴胺神經(jīng)元內(nèi)LC3、p62的表達(dá)。
　　結(jié)果：與正常對(duì)照組比較，LPS注射后1d，小鼠出現(xiàn)明顯運(yùn)動(dòng)功能障礙，黑質(zhì)部位小膠質(zhì)細(xì)胞活化數(shù)量增加、TNF-α水平和 IL-1β陽(yáng)性表達(dá)增加，LC3-Ⅱ、HDAC6、p62和α-synuclein蛋白表達(dá)水平同步增加（**P<0.01）；與單獨(dú)脂多糖組比較，低劑量（25mg/kg）和中劑量（50mg/kg）米諾環(huán)素干預(yù)組小鼠運(yùn)動(dòng)功能障礙有

10、所改善；黑質(zhì)部位小膠質(zhì)細(xì)胞活化數(shù)量、TNF-α水平和IL-1β陽(yáng)性表達(dá)均明顯減少，同時(shí)α-synuclein和 LC3-Ⅱ、HDAC6、p62的蛋白表達(dá)水平也明顯下降（**P<0.01）；中劑量（50mg/kg）米諾環(huán)素干預(yù)組多巴胺神經(jīng)元內(nèi)LC3和p62陽(yáng)性表達(dá)明顯減少；高劑量（75mg/kg）米諾環(huán)素干預(yù)組小鼠運(yùn)動(dòng)功能障礙有所加重，黑質(zhì)部位 LC3-Ⅱ和HDAC6蛋白表達(dá)水平同步增加，p62和α-synuclein蛋白表達(dá)水平也有所增