壬基酚對原代培養(yǎng)大鼠神經(jīng)元凋亡和自噬影響的研究.pdf

1、目的:壬基酚是一種重要的精細化工原料，廣泛應用于生產(chǎn)表面活性劑、紡織品、塑料、絕緣材料等領域。由于壬基酚使用范圍廣且具有難降解性和生物累積性而廣泛分布于環(huán)境中。壬基酚與雌激素具有相似的化學結構，可與機體內(nèi)的雌激素受體結合，對人和動物產(chǎn)生內(nèi)分泌干擾作用。目前對壬基酚的毒性研究主要包括對生殖、免疫、內(nèi)分泌、神經(jīng)等系統(tǒng)的影響。壬基酚神經(jīng)毒性的機理研究比較片面，還缺乏深入而系統(tǒng)的研究。
　　細胞自噬是真核生物中一種進化上高度保守的、用于降

2、解和回收利用細胞內(nèi)生物大分子和受損細胞器的過程，廣泛存在于大部分真核細胞中，是細胞降解胞內(nèi)蛋白及細胞器，保持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的一種重要方式。自噬具有兩面性，一方面，它可降解細胞中大分子物質(zhì)和功能受損的細胞器，為合成新的蛋白質(zhì)提供氨基酸和能量，同時能降解異?；蝈e誤折疊的蛋白，避免其聚積在細胞內(nèi);另一方面，自噬的功能低下或者過度活躍則會損傷細胞器等，引起異常的細胞凋亡，最后導致細胞死亡。
　　壬基酚暴露可引起細胞凋亡，尤其是神經(jīng)元凋亡，然而

3、壬基酚導致細胞凋亡的機制尚不明確。本研究通過建立大鼠神經(jīng)元壬基酚暴露模型，檢測壬基酚暴露對神經(jīng)元凋亡和自噬的影響，深入研究壬基酚暴露對神經(jīng)元自噬的影響的機制，并從自噬的角度探討壬基酚導致神經(jīng)元凋亡的機制。
　　實驗方法:1、神經(jīng)元原代培養(yǎng):取新生大鼠腦組織進行皮質(zhì)神經(jīng)元的分離制備，采用Neurobasal-A培養(yǎng)基培養(yǎng)神經(jīng)元。2、神經(jīng)元純度鑒定:MAP2免疫熒光法。3、神經(jīng)元存活率測定:MTS法。4、神經(jīng)元形態(tài)學觀察:倒置相差顯微

4、鏡觀察。5、凋亡的檢測:(1) TUNEL法(2) Western blot測定凋亡相關蛋白cleaved caspase-3表達水平。6、自噬相關蛋白的檢測:(1) Western blot法(2)免疫熒光法。
　　結果:1、神經(jīng)元MAP2純度鑒定:隨機計數(shù)100個細胞，統(tǒng)計結果顯示MAP2陽性細胞數(shù)超過90％。2、壬基酚暴露致神經(jīng)元存活率的變化:隨著壬基酚濃度升高，神經(jīng)元細胞活力逐漸降低，呈劑量-效應關系。0.01μ M組、0

5、.1μ M組、1μ M組與對照組相比，存活率略有降低但差異無統(tǒng)計學意義;10μM組、30μM組、40μM組、50μM組、60μM組、70μM組、80μM組、100μM組與對照組相比，存活率明顯降低且差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。3、壬基酚暴露致神經(jīng)元的形態(tài)學變化:隨著壬基酚濃度的增高，神經(jīng)元的數(shù)量明顯減少;神經(jīng)元的突起細小、縮短、斷裂，突起的數(shù)量也減少;細胞之間連接形成的網(wǎng)絡疏松。4、壬基酚暴露致神經(jīng)元凋亡的變化:(1) TUNEL

6、結果:隨著壬基酚濃度升高，TUNEL陽性細胞數(shù)明顯增多，各劑量組與對照組相比，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。(2) cleavedcaspase-3蛋白的表達:隨著壬基酚濃度升高，cleaved caspase-3蛋白的表達增多。與對照組相比，30μM組cleaved caspase-3蛋白的表達略有增多，但差異無統(tǒng)計學意義;50μM組和70μM組cleaved caspase-3蛋白的表達顯著增多，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05

7、）。5、壬基酚暴露致神經(jīng)元自噬的變化:(1)自噬相關蛋白LC3、p62的表達:隨著壬基酚濃度升高，LC3蛋白表達增多。30μM組與對照組相比，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值增高，但差異無統(tǒng)計學意義;50μM組和70μM組與對照組相比，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值顯著增增高，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。隨著壬基酚暴露濃度的升高，LC3陽性細胞的熒光強度越來越強，說明LC3的表達越來越多。隨著壬基酚濃度升高，p62蛋白表達減少，各劑量組與對

8、照組相比，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。隨著壬基酚濃度升高，p62陽性細胞的熒光強度越來越弱，說明p62的表達越來越少。(2)自噬調(diào)控蛋白Beclin1、p-mTOR、mTOR的表達:隨著壬基酚濃度升高，Beclin1蛋白的表達增多，與對照組相比，30μM組Beclin1表達增多，但差異無統(tǒng)計學意義;50μM組和70μM組Beclin1顯著增多，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。隨著壬基酚濃度升高，p-mTOR蛋白表達減少，各劑

9、量組與對照組相比，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。隨著壬基酚濃度升高，mTOR蛋白的表達基本沒有變化。(3)溶酶體膜蛋白LAMP2的表達:隨著壬基酚濃度升高，LAMP2蛋白的表達增多，與對照組相比，70μ M組LAMP2顯著增多，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。
　　結論:1、壬基酚暴露導致原代培養(yǎng)的神經(jīng)元凋亡增加。2、壬基酚暴露導致原代培養(yǎng)的神經(jīng)元自噬增強。3、壬基酚通過上調(diào)Beclin1的表達和下調(diào)p-mTOR的表達導致