壬基酚對原代培養(yǎng)大鼠神經(jīng)元凋亡和自噬影響的研究.pdf

1、目的:壬基酚是一種重要的精細(xì)化工原料，廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)表面活性劑、紡織品、塑料、絕緣材料等領(lǐng)域。由于壬基酚使用范圍廣且具有難降解性和生物累積性而廣泛分布于環(huán)境中。壬基酚與雌激素具有相似的化學(xué)結(jié)構(gòu)，可與機(jī)體內(nèi)的雌激素受體結(jié)合，對人和動(dòng)物產(chǎn)生內(nèi)分泌干擾作用。目前對壬基酚的毒性研究主要包括對生殖、免疫、內(nèi)分泌、神經(jīng)等系統(tǒng)的影響。壬基酚神經(jīng)毒性的機(jī)理研究比較片面，還缺乏深入而系統(tǒng)的研究。
　　細(xì)胞自噬是真核生物中一種進(jìn)化上高度保守的、用于降

2、解和回收利用細(xì)胞內(nèi)生物大分子和受損細(xì)胞器的過程，廣泛存在于大部分真核細(xì)胞中，是細(xì)胞降解胞內(nèi)蛋白及細(xì)胞器，保持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的一種重要方式。自噬具有兩面性，一方面，它可降解細(xì)胞中大分子物質(zhì)和功能受損的細(xì)胞器，為合成新的蛋白質(zhì)提供氨基酸和能量，同時(shí)能降解異常或錯(cuò)誤折疊的蛋白，避免其聚積在細(xì)胞內(nèi);另一方面，自噬的功能低下或者過度活躍則會(huì)損傷細(xì)胞器等，引起異常的細(xì)胞凋亡，最后導(dǎo)致細(xì)胞死亡。
　　壬基酚暴露可引起細(xì)胞凋亡，尤其是神經(jīng)元凋亡，然而

3、壬基酚導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的機(jī)制尚不明確。本研究通過建立大鼠神經(jīng)元壬基酚暴露模型，檢測壬基酚暴露對神經(jīng)元凋亡和自噬的影響，深入研究壬基酚暴露對神經(jīng)元自噬的影響的機(jī)制，并從自噬的角度探討壬基酚導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡的機(jī)制。
　　實(shí)驗(yàn)方法:1、神經(jīng)元原代培養(yǎng):取新生大鼠腦組織進(jìn)行皮質(zhì)神經(jīng)元的分離制備，采用Neurobasal-A培養(yǎng)基培養(yǎng)神經(jīng)元。2、神經(jīng)元純度鑒定:MAP2免疫熒光法。3、神經(jīng)元存活率測定:MTS法。4、神經(jīng)元形態(tài)學(xué)觀察:倒置相差顯微

4、鏡觀察。5、凋亡的檢測:(1) TUNEL法(2) Western blot測定凋亡相關(guān)蛋白cleaved caspase-3表達(dá)水平。6、自噬相關(guān)蛋白的檢測:(1) Western blot法(2)免疫熒光法。
　　結(jié)果:1、神經(jīng)元MAP2純度鑒定:隨機(jī)計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示MAP2陽性細(xì)胞數(shù)超過90％。2、壬基酚暴露致神經(jīng)元存活率的變化:隨著壬基酚濃度升高，神經(jīng)元細(xì)胞活力逐漸降低，呈劑量-效應(yīng)關(guān)系。0.01μ M組、0

5、.1μ M組、1μ M組與對照組相比，存活率略有降低但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;10μM組、30μM組、40μM組、50μM組、60μM組、70μM組、80μM組、100μM組與對照組相比，存活率明顯降低且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。3、壬基酚暴露致神經(jīng)元的形態(tài)學(xué)變化:隨著壬基酚濃度的增高，神經(jīng)元的數(shù)量明顯減少;神經(jīng)元的突起細(xì)小、縮短、斷裂，突起的數(shù)量也減少;細(xì)胞之間連接形成的網(wǎng)絡(luò)疏松。4、壬基酚暴露致神經(jīng)元凋亡的變化:(1) TUNEL

6、結(jié)果:隨著壬基酚濃度升高，TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)明顯增多，各劑量組與對照組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。(2) cleavedcaspase-3蛋白的表達(dá):隨著壬基酚濃度升高，cleaved caspase-3蛋白的表達(dá)增多。與對照組相比，30μM組cleaved caspase-3蛋白的表達(dá)略有增多，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;50μM組和70μM組cleaved caspase-3蛋白的表達(dá)顯著增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05

7、）。5、壬基酚暴露致神經(jīng)元自噬的變化:(1)自噬相關(guān)蛋白LC3、p62的表達(dá):隨著壬基酚濃度升高，LC3蛋白表達(dá)增多。30μM組與對照組相比，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值增高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;50μM組和70μM組與對照組相比，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值顯著增增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。隨著壬基酚暴露濃度的升高，LC3陽性細(xì)胞的熒光強(qiáng)度越來越強(qiáng)，說明LC3的表達(dá)越來越多。隨著壬基酚濃度升高，p62蛋白表達(dá)減少，各劑量組與對

8、照組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。隨著壬基酚濃度升高，p62陽性細(xì)胞的熒光強(qiáng)度越來越弱，說明p62的表達(dá)越來越少。(2)自噬調(diào)控蛋白Beclin1、p-mTOR、mTOR的表達(dá):隨著壬基酚濃度升高，Beclin1蛋白的表達(dá)增多，與對照組相比，30μM組Beclin1表達(dá)增多，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;50μM組和70μM組Beclin1顯著增多，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。隨著壬基酚濃度升高，p-mTOR蛋白表達(dá)減少，各劑

9、量組與對照組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。隨著壬基酚濃度升高，mTOR蛋白的表達(dá)基本沒有變化。(3)溶酶體膜蛋白LAMP2的表達(dá):隨著壬基酚濃度升高，LAMP2蛋白的表達(dá)增多，與對照組相比，70μ M組LAMP2顯著增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　結(jié)論:1、壬基酚暴露導(dǎo)致原代培養(yǎng)的神經(jīng)元凋亡增加。2、壬基酚暴露導(dǎo)致原代培養(yǎng)的神經(jīng)元自噬增強(qiáng)。3、壬基酚通過上調(diào)Beclin1的表達(dá)和下調(diào)p-mTOR的表達(dá)導(dǎo)致