小檗堿的生物代謝反應及代謝產(chǎn)物活性的研究.pdf

1、小檗堿(Berberine，BBR)是從黃連等植物根莖中提取分離的異喹啉類天然抗腹瀉藥物，在我國臨床使用已有數(shù)十年的歷史。最近，我們發(fā)現(xiàn)BBR是一個作用機制與他汀類完全不同的新型降血脂藥物，主要在轉(zhuǎn)錄后水平通過上調(diào)肝細胞低密度脂蛋白受體(LDLR)的基因表達，進而發(fā)揮降血脂作用。此外，我們還發(fā)現(xiàn)胰島素受體(InsR)是BBR發(fā)揮降血糖作用的另一個關鍵靶點。提示，BBR顯示出治療代謝綜合征(MS)的潛力。然而，BBR的代謝酶及其代謝產(chǎn)物的

2、活性至今未知。本論文首先從藥物代謝的角度，探討B(tài)BR的代謝途徑，尋找BBR經(jīng)機體生物轉(zhuǎn)化后的活性代謝產(chǎn)物及其代謝相關的肝臟CYP450(cytochromeP450)酶，繼而從活性代謝產(chǎn)物著手，開展前藥的設計，以期獲得具有自主知識產(chǎn)權、較高口服生物利用度的治療MS候選化合物。
　　 為了研究BBR的Ⅰ相代謝產(chǎn)物，我們設計了一系列體內(nèi)外實驗。大鼠口服200mg/kg的BBR后，主要的Ⅰ相代謝產(chǎn)物有4個，分別是小檗紅堿(berber

3、rubine，M1)、唐松草分定(thalifendine，M2)、2,3-去亞甲基小檗堿(demethyleneberberine，M3)和藥根堿(jatrorrhizine，M4)。對于BBR經(jīng)人體肝藥酶的代謝，我們分別從人肝微粒體和重組表達人源P450酶的昆蟲微粒體的亞細胞水平，以及3種人肝細胞（人原代肝細胞、Bel-7402和HepG2）的細胞水平進行了考察，僅得到2種代謝產(chǎn)物，M2和M3。自大鼠的肝臟組織分別制備了肝勻漿、S9

4、及微粒體，在體外模擬生理環(huán)境對BBR進行孵育，所得結果與人肝體外結果相似。我們認為，在當前構建的幾種的肝臟體外代謝模型中，BBR的主要Ⅰ相代謝產(chǎn)物為M2和M3。
　　 為了進一步考察負責代謝BBR的肝臟P450酶，我們運用計算機小分子與生物大分子的對接手段預測了能夠與BBR緊密結合的CYP450蛋白，按照對接評分由高到低分別為CYP2D6、CYPIA2、CYP3A4。接下來，將BBR與8種重組P450酶分別孵育，并結合化學抑制劑

5、實驗共同驗證了酶篩結果。最后利用整體歸一化法(totalnormalizedrate，TNR)對負責代謝BBR的CYP450酶進行了相對貢獻值的評估排序。對于M2的生成,3種酶的相對貢獻值分別為CYPIA2：78.38％，CYP2D6：18.97%，CYP3A4：2.65%；對于M3的生成,3種酶的相對貢獻值分別為CYP3A4：38.43%，CYP1A2：31.18%,CYP2D6：30.39%。
　　 為了深刻理解BBR在體內(nèi)

6、發(fā)揮藥理作用的機制和物質(zhì)基礎，我們分別考察了BBR及其體內(nèi)代謝產(chǎn)物M1-M4上調(diào)肝細胞LDLRmRNA的表達、上調(diào)InsRmRNA的表達及激活AMPK酶的活性，結果顯示，代謝產(chǎn)物M1-M4的活性均表現(xiàn)出一定的活性，但卻不及BBR母體本身，我們推測BBR進入體內(nèi)后，與其代謝產(chǎn)物共同發(fā)揮調(diào)脂降糖的作用。在其4個代謝產(chǎn)物中M1的活性最高，雖然稍弱于BBR本身，但結構中裸露出的羥基(9-OH)使其通過制備前藥而改善BBR的藥代動力學特性、提高B

7、BR的口服生物利用度成為可能。
　　 我們從活性代謝產(chǎn)物M1著手，在其9-OH引入脂溶性增加的載體，制備成M1前藥。通過在大鼠血漿中的體外生物轉(zhuǎn)化實驗的篩選及動物體內(nèi)降血脂活性的評價，從中篩選出生物利用度高、降血脂活性略強于或與BBR相當?shù)孽ヮ惽八帯狹1棕櫚酸酯(5g)。5g不僅擁有自主知識產(chǎn)權，還在BBR的基礎上大大提高了生物利用度，安全性高、藥效好，具有良好的應用前景，將BBR轉(zhuǎn)化為具有創(chuàng)新性的新型代謝綜合征治療藥物。