乙型腦炎病毒NS5和E蛋白單抗的制備及其特性分析.pdf

1、乙型腦炎(Japanese encephalitis，JE)是由乙型腦炎病毒(Japanese encephalitisvirus，JEV)引起的一種危害嚴(yán)重的蟲(chóng)媒性人畜共患病。JEV主要是通過(guò)豬和蚊子進(jìn)行傳播，感染后主要引起母豬流產(chǎn)、死胎以及公豬的睪丸炎，不僅對(duì)養(yǎng)豬業(yè)造成很大的損失，同時(shí)也嚴(yán)重威脅人類(lèi)的健康。
　　 本研究用原核表達(dá)的NS5蛋白和純化的JEV分別免疫小鼠，經(jīng)過(guò)細(xì)胞融合篩選到了6株特異性的JEV NS5蛋白單抗和

2、5株E蛋白單抗，并對(duì)這些單抗的生物學(xué)特性進(jìn)行了驗(yàn)證，具體研究?jī)?nèi)容如下:
　　 1.JEV NS5蛋白單克隆抗體的制備及其靶抗原表位的研究
　　 利用原核表達(dá)的JEV NS5蛋白免疫小鼠，通過(guò)細(xì)胞融合篩選到了6株特異性的單克隆抗體，分別為:1G6、1F12、2A5、3C4、3H7、3F10，亞型分別為IgG2b、IgG2a、IgG2b、IgG1、IgG2a和IgG2a，輕鏈均為Kappa鏈。經(jīng)間接免疫熒光(IFA)和Wes

3、tern blot檢測(cè)，這6株單抗均具有較好的特異性。在此基礎(chǔ)上，構(gòu)建NS5真核分片段表達(dá)質(zhì)粒pCMV-NS5(1-405)，pCMV-NS5(406-905)并將之分別轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，然后通過(guò)IFA檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，上述6株單抗有2株(1F12、3F10)的靶抗原表位位于NS5蛋白的甲基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域，有4株(1G6、2A5、3C4、3H7)的靶抗原表位位于RNA依賴(lài)的RNA聚合酶(RdRp)結(jié)構(gòu)域。進(jìn)一步經(jīng)過(guò)序列比對(duì)、分段表達(dá)以及合成多肽，

4、鑒定出3C4株單抗的靶抗原表位是位于NS5蛋白的432位的精氨酸殘基。
　　 2.JEV E蛋白單克隆抗體的篩選和中和活性的檢測(cè)
　　 本研究用擴(kuò)增的JEV SA14-14-2疫苗株免疫小鼠，通過(guò)細(xì)胞融合篩選到了5株E蛋白的特異性單克隆抗體，分別為:2A5、2H12、3H10、4B4、4E1，其亞型分別為IgG1、IgG2b、IgG2b、IgG2b和IgG2b，輕鏈均為Kappa鏈。經(jīng)間接免疫熒光和Western blo