Smad1互作蛋白chmp1b的篩選及初步鑒定分析.pdf

1、Tgf-β生長因子在肺發(fā)育過程中對胎兒及新生兒腫發(fā)育過程中肺上皮細胞的生長、分化、免疫調(diào)節(jié)、細胞外基質(zhì)的合成及肺組織損傷后的修復(fù)等過程都起著著重要的作用。BMPs是Tgf-β超家族中的一個重要組成部分，而Smad1是BMP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中重要的細胞內(nèi)信號分子，BMP的信號傳導(dǎo)過程始于對跨膜的BMPⅠ型和Ⅱ型受體的激活，激活的Ⅰ型受體對下游負責(zé)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)的Smad1/5/8進行磷酸化，此后Smad1/5/8再與胞內(nèi)的Smad4結(jié)合，并以復(fù)

2、合體的形式進入細胞核內(nèi)與特異性轉(zhuǎn)錄因子一起調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達。而通過敲除小鼠肺上皮細胞中的BMP基因抑制其表達會造成胎鼠產(chǎn)前肺發(fā)育畸形等致死性結(jié)果。所以，針對這條重要的信號通路以及其中涉及的各種信號分子之間作用的探索近年來成為了肺發(fā)育與疾病領(lǐng)域中研究的熱點問題。
　　 發(fā)育過程中，小鼠胚胎肺上皮細胞中敲除Smad1會導(dǎo)致其分化過程受到影響，并會最終導(dǎo)致新生呼吸衰竭。而Smad1本身作為一種細胞內(nèi)信號分子其作用的發(fā)揮需要互作蛋白的

3、協(xié)助。因此本實驗通過酵母雙雜交體系對E18.5天小鼠胚胎肺文庫中與Smad1可能存在相互作用的蛋白進行篩選，并用多種方式對前期篩選出的chmp1b是否與Smad1在體內(nèi)及體外存在相互作用進行初步確認(rèn)，同時檢查chmp1b其在不同發(fā)育階段肺內(nèi)的表達水平，為研究TGF-β信號通路對肺發(fā)育的影響探尋新的思路
　　 方法：
　　 1、酵母雙雜交文庫的建立
　　 2、Smad1誘餌載體的構(gòu)建
　　 3、Smad1酵

4、母互作蛋白的篩選
　　 4、chmp1b與Smad1不同結(jié)構(gòu)域的酵母體外小規(guī)模mating互作驗證確認(rèn)
　　 5、pcmb1質(zhì)粒的構(gòu)建。
　　 6、chmp1與Smad1的細胞內(nèi)熒光共定位實驗
　　 7、Halo-tag pull down驗證chmp1b與Smad1的互作
　　 8、用Realtime PCR檢測不同發(fā)育階段肺組織chmp1b表達量水平
　　 結(jié)果：
　　 1、小

5、鼠E18.5酵母雙雜交文庫建立完成。
　　 2、構(gòu)建了Smad1誘餌載體并通過酵母互作蛋白篩選體系篩選出640個酵母克隆菌株
　　 3、通過體外小規(guī)模mating實驗確認(rèn)酵母中chmp1b與Smad1的MH2區(qū)互作
　　 4、pcmb1質(zhì)粒的構(gòu)建成功。
　　 5、chmp1b與Smad1細胞內(nèi)熒光共聚焦實驗顯示在胞核和胞漿中存在共定位
　　 6、Halo-tag pull down實驗結(jié)果證明ch