華支睪吸蟲CsSP15新基因的發(fā)現(xiàn)及其表達(dá)產(chǎn)物免疫學(xué)功能初步研究.pdf

1、目的：利用生物信息學(xué)方法對(duì)新發(fā)現(xiàn)的華支睪吸蟲基因CsSP15編碼的蛋白進(jìn)行結(jié)構(gòu)和功能預(yù)測，并利用基因工程技術(shù)進(jìn)行克隆和表達(dá)，獲得相應(yīng)的重組蛋白，初步研究重組蛋白的免疫學(xué)特性，探討其作為診斷候選抗原分子的潛在價(jià)值。 方法：華支睪吸蟲成蟲CsSP15的生物信息學(xué)分析；CsSP15基因的克隆、表達(dá)和純化；重組蛋白的免疫學(xué)功能研究。 結(jié)果：①CsSP15生物信息學(xué)分析。CsSP15基因全長590bp，含有4個(gè)可能的開放讀碼框，最

2、大的開放讀碼框(ORF)位于51-515bp，含465bp，編碼155aa，起始密碼ATG，終止密碼TGA，理論分子量為17.10kDa，等電點(diǎn)PI為8.55。CsSP15基因序列的BLASTX結(jié)果顯示，與CsSP15同源性最高的為日本血吸蟲功能未知蛋白基因(登錄號(hào)：56752713、567554146)，一致性達(dá)43％，相似性達(dá)63％；CsSP15基因推導(dǎo)的氨基酸序列與多個(gè)物種附睪分泌蛋白的氨基酸序列有一定的同源性。利用ExPASY中

3、SignalP程序在線分析發(fā)現(xiàn)：CsSP15序列的氨基端有一段剪切位點(diǎn)位于地17-18位氨基酸之間的信號(hào)肽。RPS—BLAST和InterProScan程序?qū)sSP15功能域搜索，發(fā)現(xiàn)其具有參與胞內(nèi)膽固醇的識(shí)別和轉(zhuǎn)運(yùn)的機(jī)構(gòu)域Npc2和ML結(jié)構(gòu)域，還具有與變態(tài)反應(yīng)相關(guān)的Der—P—2樣結(jié)構(gòu)域。②CsSP15基因的克隆、表達(dá)和純化。利用基因的特異性引物擴(kuò)增出CsSP15目的片段，定向克隆獲得的重組原核表達(dá)質(zhì)粒pGEX—4T-1-CsSP1

4、5經(jīng)PCR、雙酶切和測序證實(shí)構(gòu)建成功。重組質(zhì)粒在IPTG誘導(dǎo)下以包涵體形式成功表達(dá)出融合蛋白，經(jīng)SDS—PAGE顯示與理論預(yù)測的融合蛋白分子量相符。CsSP15-GST融合蛋白經(jīng)切膠純化成功。③融合蛋白的免疫學(xué)功能研究。純化的CsSP15-GST蛋白免疫大鼠，獲得了大鼠抗CsSP15和抗GST的免疫血清。Western blotting顯示CsSP15-GST融合蛋白能被處理組免疫血清和大鼠感染血清所識(shí)別，而對(duì)照免疫血清和陰性大鼠血清不

5、能識(shí)別融合蛋白。通過ELISA檢測不同感染度病人血清總IgG發(fā)現(xiàn)：在輕、中、重度各16例的華支睪吸蟲病人中陽性檢出數(shù)分別為13、14、11。故在48例陽性病人血清中，陽性檢出數(shù)38例，敏感性達(dá)79.16％。 結(jié)論：⑴純化的CsSP15-GST融合蛋白具有免疫原性和抗原性。⑵CsSP15并非蟲體結(jié)構(gòu)蛋白，可能是蟲體的分泌蛋白，是華支睪吸蟲分泌排泄抗原組分之一。⑶重組CsSP15用于華支睪吸蟲血清學(xué)診斷的敏感性約79.16％，對(duì)輕度