AIF和EndoG介導(dǎo)的線(xiàn)粒體相關(guān)問(wèn)號(hào)鉤端螺旋體誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞凋亡的研究.pdf

1、目的：致病性問(wèn)號(hào)鉤端螺旋體(簡(jiǎn)稱(chēng)鉤體)可以在體外誘導(dǎo)小鼠單核巨噬細(xì)胞系J774A.1細(xì)胞凋亡，但是具體的凋亡機(jī)制還未闡明。本研究的目的是探討AIF和EndoG線(xiàn)粒體相關(guān)途徑在問(wèn)號(hào)鉤體誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞凋亡中的作用。
　　 方法：⑴致病性問(wèn)號(hào)鉤體黃疸出血群賴(lài)型賴(lài)株體外誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞凋亡：鉤體分別與小鼠腹腔巨噬細(xì)胞(MPMs)，小鼠單核巨噬樣細(xì)胞系J774A.1細(xì)胞，人單核樣細(xì)胞系THP-1細(xì)胞，共同孵育。采用AnnexinV-FITC和

2、PI雙染法，通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)鉤體感染后巨噬細(xì)胞凋亡率。⑵透射電鏡觀察誘導(dǎo)凋亡的巨噬細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變，尤其是線(xiàn)粒體改變。⑶應(yīng)用活性檢測(cè)試劑盒測(cè)定鉤體感染后的巨噬細(xì)胞的caspase-8，caspase-9活性變化；非特異性Caspase阻斷劑對(duì)凋亡的影響；JC-1染色后流式細(xì)胞儀和熒光顯微鏡檢測(cè)線(xiàn)粒體膜電位(MPT)變化，應(yīng)用熒光探針DCFH-DA檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的活性氧(ROS)水平。⑷Western blot分別檢測(cè)誘導(dǎo)鉤體感染后的巨噬細(xì)

3、胞在感染不同時(shí)間后的線(xiàn)粒體或胞漿成份中的細(xì)胞色素C，EndoG，AIF和Smac的表達(dá)，同時(shí)應(yīng)用免疫熒光染色法檢測(cè)相應(yīng)蛋白的轉(zhuǎn)位。MPT阻斷劑預(yù)處理細(xì)胞后，對(duì)凋亡及線(xiàn)粒體釋放蛋白的影響。(5)應(yīng)用基因芯片技術(shù)檢測(cè)鉤體感染后的巨噬細(xì)胞的凋亡相關(guān)基因Bcl-2家族的mRNA表達(dá)水平變化，對(duì)表達(dá)發(fā)生變化的及代表性Bcl-2家族基因的應(yīng)用Real-time PCR再次確認(rèn)mRNA水平變化。
　　 結(jié)果：①致病性問(wèn)號(hào)鉤體黃疸出血群賴(lài)型賴(lài)株

4、體外能成功誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞凋亡，顯示問(wèn)號(hào)鉤體賴(lài)株可誘導(dǎo)3種巨噬細(xì)胞均出現(xiàn)不同程度的細(xì)胞凋亡，細(xì)胞凋亡率在一定范圍內(nèi)，隨著感染時(shí)間延長(zhǎng)和感染菌量的增加而升高。但是感染菌量過(guò)高時(shí)，細(xì)胞凋亡率開(kāi)始下降，同時(shí)細(xì)胞壞死率升高。②透射電鏡結(jié)果顯示：感染問(wèn)號(hào)鉤體后，3種巨噬細(xì)胞均出現(xiàn)細(xì)胞凋亡的特征，例如染色質(zhì)濃縮和邊緣化，新月形核，細(xì)胞空泡化，細(xì)胞線(xiàn)粒體腫脹和嵴消失，但是3種被感染巨噬細(xì)胞的形態(tài)改變之間無(wú)明顯差異。③問(wèn)號(hào)鉤體賴(lài)株感染3種巨噬細(xì)胞后，均可檢

5、測(cè)到caspase-8活性明顯升高，caspase-9活性無(wú)明顯升高；但是非特異性caspase抑制劑不能完全阻斷細(xì)胞凋亡。被鉤體感染后，3種巨噬細(xì)胞線(xiàn)粒體膜電位均隨著感染時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸下降。其中，MPMs的MPT下降幅度大于J774A.1和THP-1細(xì)胞。此外，與正常對(duì)照細(xì)胞相比，被鉤體感染的3種巨噬細(xì)胞均出現(xiàn)胞內(nèi)活性氧(ROS)水平升高。④Westem Blot顯示，在問(wèn)號(hào)鉤體賴(lài)株誘導(dǎo)3種巨噬細(xì)胞凋亡的過(guò)程中，在MPMs和J774

6、A.1細(xì)胞中檢測(cè)到AIF和EndoG從線(xiàn)粒體釋放到胞漿，在THP-1細(xì)胞中檢測(cè)到AIF從線(xiàn)粒體釋放到胞漿；但是未檢測(cè)到細(xì)胞色素C和Smac從線(xiàn)粒體釋放到胞漿。但是免疫熒光染色證實(shí)鉤體感染后AIF或EndoG從線(xiàn)粒體轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。MPT阻斷劑可以部分性阻斷細(xì)胞凋亡，完全阻斷AIF或EndoG的釋放。⑤線(xiàn)粒體相關(guān)的凋亡調(diào)節(jié)蛋白，Bcl-2家族的mRNA表達(dá)水平檢測(cè)結(jié)果顯示：鉤體感染后3種巨噬細(xì)胞后，Bcl-2家族抗凋

7、亡基因Bcl-2，Bcl-XL均無(wú)明顯變化，但是促凋亡基因Bid，Bikl，Bnip3，Bcor，Bcl-211和Bclafl在MPMs和J774A.1細(xì)胞中表達(dá)明顯上調(diào)，促凋亡基因Bid， Bikl，Bnip3， Bcl-211和Bclafl在THP-1細(xì)胞中小幅上調(diào)，其他促凋亡基因無(wú)明顯變化。
　　 結(jié)論：⑴致病性的問(wèn)號(hào)鉤體黃疸出血群賴(lài)型賴(lài)株可以誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞凋亡。⑵問(wèn)號(hào)鉤體賴(lài)株通過(guò)caspase依賴(lài)的caspase-8途徑和