堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子在活性全層皮膚構(gòu)建中的作用.pdf

1、目的：
　　人工培養(yǎng)皮膚于20世紀(jì)80年代開發(fā)成功，開皮膚再生醫(yī)學(xué)的先河。然而，人工培養(yǎng)皮膚在形態(tài)和功能上與正常皮膚有較大的差距，因此培養(yǎng)皮膚質(zhì)量的不斷改良是研究者們不懈努力的目標(biāo)，更是臨床應(yīng)用的迫切需要。bFGF又稱為FGF2，影響細(xì)胞的增殖、遷移和分化。bFGF不僅刺激成纖維細(xì)胞增殖和膠原蛋白的分泌，對(duì)血管新生也有強(qiáng)烈的促進(jìn)作用?；蛑亟MbFGF在臨床上已經(jīng)有了較長(zhǎng)時(shí)間的應(yīng)用，對(duì)培養(yǎng)皮膚的構(gòu)成細(xì)胞—成纖維細(xì)胞以及表皮角化細(xì)胞都

2、有直接或間接的影響。在活性全層皮膚的培養(yǎng)過(guò)程中添加bFGF，對(duì)培養(yǎng)皮膚進(jìn)行組織形態(tài)學(xué)以及細(xì)胞狀態(tài)研究。我們期待bFGF的添加能夠改善培養(yǎng)皮膚的質(zhì)量，同時(shí)以該培養(yǎng)皮膚為模型，探討bFGF在皮膚創(chuàng)傷修復(fù)中的作用。
　　方法：
　　從手術(shù)時(shí)廢棄的剩余正常皮膚分離出表皮角化細(xì)胞和成纖維細(xì)胞并體外培養(yǎng)擴(kuò)增。采用第4代表皮角化細(xì)胞構(gòu)建全層活性皮膚（living skin equivalent, LSE），第5代真皮成纖維細(xì)胞構(gòu)建活性全層

3、皮膚(LSE)。準(zhǔn)備I型牛膠原溶液（Sigma公司，美國(guó))6容量，0.1N NaOH1容量，8倍濃度DMEM1容量，20％FCS/DMEM10容量，將上述溶液在4℃進(jìn)行混合。每個(gè)insert(Transwel-COL, membrane pore size,3μm, Costar;Corning公司，美國(guó))中添加1ml，于室溫靜置10分鐘，使其膠凍化。在10%FCS/DMEM培養(yǎng)基中，調(diào)制成纖維細(xì)胞為5x105個(gè)/ml。將該細(xì)胞懸液2容

4、量與上述膠原混合液8容量進(jìn)行混合，每個(gè)insert緩慢注入3.5ml后待其膠凍化，而后添加10%FCS/DMEM培養(yǎng)基，于細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置。5日后，在收縮凹陷的膠原凝膠上播種表皮角化細(xì)胞，液相下培養(yǎng)2日待細(xì)胞達(dá)到融合后，開始?xì)庖好媾囵B(yǎng)。在培養(yǎng)基中添加30ng/ml bFGF（珠海億勝生物制藥有限公司，中國(guó)），對(duì)照組添加等劑量的無(wú)菌注射用水，每2日換液一次。在氣液面培養(yǎng)后的不同時(shí)點(diǎn)（2周、3周、4周）采取LSE樣本，進(jìn)行石蠟包埋。制作6μ

5、m厚石蠟切片，進(jìn)行Hematoxylin-eosin(HE)染色和免疫組織化學(xué)染色。圖像由奧林帕斯 AX80顯微鏡耦合奧林帕斯 DP50數(shù)碼相機(jī)(Olympus公司，日本)拍攝獲取。采用image-pro plus6.0(ipp)圖像分析軟件分別測(cè)量實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的真皮層厚度，統(tǒng)計(jì)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤（χ±S(χ)）的形式表示，各周的兩組數(shù)據(jù)之間比較采用t檢驗(yàn)，P值<0.05，P值<0.01為有顯著性差異。
　　結(jié)果：
　　一

6、、組織學(xué)所見(jiàn)
　　HE染色結(jié)果顯示，氣液面培養(yǎng)2周時(shí)，bFGF添加組和未添加組的真皮厚度可見(jiàn)明顯差異。3周、4周，bFGF添加組仍保留了較厚的真皮成分。
　　二、免疫組化染色
　　1.分化型keratin的表現(xiàn)
　　bFGF非添加組2周、3周，Keratin1在表皮上層表達(dá)，但是第4周幾乎全部消失；bFGF添加組2周、3周，Keratin1也在表皮上層表達(dá)，但是與bFGF非添加組相比，Keratin1的表現(xiàn)更接近

7、正常皮膚的表現(xiàn)并持續(xù)到4周。Keratin10在bFGF非添加組幾乎沒(méi)有表達(dá)；而在bFGF添加組2周、3周、4周，Keratin10主要以棘層為中心表達(dá)。
　　2.增殖型keratin的表現(xiàn)
　　作為增殖型keratin的keratin6和keratin16的染色有基本相同的表現(xiàn)形式。在bFGF未添加組2周、3周、4周，keratin6和keratin16從基底層到棘層有非常強(qiáng)的表現(xiàn)，其中3周的表現(xiàn)最強(qiáng)；與未添加組相比，bF

8、GF添加組的keratin6和keratin16全時(shí)點(diǎn)的表達(dá)明顯受到抑制。
　　3.α-SMA的表現(xiàn)
　　α-SMA作為肌成纖維細(xì)胞的標(biāo)記物，在增生性瘢痕中有較強(qiáng)的表現(xiàn)。在bFGF未添加組，2周于表皮和真皮交界處可見(jiàn)α-SMA陽(yáng)性細(xì)胞，3周表現(xiàn)增強(qiáng)，一直持續(xù)到第4周；而在bFGF添加組，2周、3周、4周都僅有極少量的α-SMA陽(yáng)性細(xì)胞。與bFGF未添加組相比，bFGF添加組α-SMA的表達(dá)被顯著抑制。
　　三、真皮厚度

9、的測(cè)量
　　氣液面培養(yǎng)，表皮重層化開始后2周、3周、4周分別測(cè)量bFGF添加組和未添加組的真皮厚度，bFGF添加組的真皮厚度明顯厚于未添加組，t檢驗(yàn)結(jié)果顯示各時(shí)間點(diǎn)的兩組間比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（*P<0.05,**P<0.01）。
　　結(jié)論：
　　構(gòu)建活性全層皮膚時(shí)，在培養(yǎng)基中加入 bFGF，抑制了真皮成分的菲薄化，使表皮的增殖和分化狀態(tài)更接近正常皮膚，并且bFGF的添加抑制了肌成纖維細(xì)胞的形成，提示對(duì)瘢痕的形成有抑制作