體外多胺微環(huán)境對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2轉(zhuǎn)移的影響.pdf

1、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?
　　多胺是一種長(zhǎng)鏈脂肪族化合物，天然多胺主要包括腐胺(putrescine，Put)、精胺(spermine，spm)和精脒（亞精胺）(spermidine，spd)。多胺廣泛存在于自然界，是大多數(shù)生命器官所必需的。生理性多胺在人體組織和體液中的含量非常少，而在腫瘤組織中多胺含量比正常組織中顯著增加且與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)外加多胺來(lái)模擬人體高、正常（中）和低三種不同多胺微環(huán)境對(duì)肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)、侵襲、

2、轉(zhuǎn)移等能力及相關(guān)分子機(jī)制的研究。
　　實(shí)驗(yàn)方法:
　　選取人肝癌細(xì)胞HepG2作為研究對(duì)象，使用基因轉(zhuǎn)染技術(shù)把Akt3基因轉(zhuǎn)到HepG2細(xì)胞中。把外源性多胺按高多胺濃度(腐胺0.8 nmol/mL、精脒10.0 nmol/mL、精胺5.0nmol/mL);正常多胺濃度(腐胺0.08 nmol/mL、精脒1.0 nmol/mL、精胺0.5 nmol/mL);低多胺濃度(腐胺0.008 nmol/mL、精脒0.1 nmol/mL

3、、精胺0.05 nmol/mL)三組多胺分別加入含有相同培養(yǎng)基的HepG2細(xì)胞和HepG2-Akt3細(xì)胞中，培養(yǎng)15天和30天。每種細(xì)胞另設(shè)陰性對(duì)照。應(yīng)用克隆形成能力實(shí)驗(yàn)來(lái)檢測(cè)不同多胺濃度對(duì)兩種不同細(xì)胞增殖能力的影響;應(yīng)用Transwell遷移實(shí)驗(yàn)（未鋪膠）來(lái)檢測(cè)不同多胺濃度對(duì)兩種不同細(xì)胞遷移能力的影響;運(yùn)用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)來(lái)檢測(cè)不同多胺濃度對(duì)兩種不同細(xì)胞傷口愈合能力的影響;運(yùn)用蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)(Western blot)來(lái)分析不同多胺微環(huán)

4、境對(duì)與腫瘤細(xì)胞粘附遷移、侵襲等相關(guān)的各種蛋白表達(dá)的影響，如鳥(niǎo)氨酸脫羧酶(omithine decarbo-xylase，ODC)、精脒/精胺乙酰轉(zhuǎn)移酶(spermidine/spermine N1-acetyltransferase，SSAT)、AKT、P27kip1、低氧誘導(dǎo)因子(hypoxia-inducible factor-1α，HIF1α)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelialgrowth factor,

5、 VEGF)、鈣粘附蛋白(E-cadherin)、整合素(Integrinα6)、Akt3、組織蛋白酶D(Cathepsin D)等蛋白的變化。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　HepG2及HepG2-AKt3細(xì)胞在不同多胺微環(huán)境下顯示了不同的增殖、遷移、侵襲能力，而且隨著多胺濃度的升高其增殖、遷移、侵襲能力逐漸增強(qiáng)，并成時(shí)間劑量依賴(lài)性。HepG2-AKt3細(xì)胞在相同多胺濃度的情況下其增殖、遷移、侵襲能力比HepG2細(xì)胞顯著增強(qiáng)。蛋白免

6、疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明多胺是通過(guò)誘導(dǎo)AKt3蛋白、低氧誘導(dǎo)因子(HIF1α)蛋白、鳥(niǎo)氨酸脫羧酶(ODC)、精脒/精胺乙酰轉(zhuǎn)移酶(SSAT)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、整合素(Integrinα6)、組織蛋白酶D(Cathepsin D)蛋白的上調(diào)以及P27kip1蛋白、上皮鈣粘附蛋白(E-cadherin)的下調(diào)等促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)論:
　　高多胺微環(huán)境能夠促進(jìn)HepG2細(xì)胞和HepG2-Akt3細(xì)