CKS對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2增殖與凋亡的調(diào)控作用.pdf

1、目的：
　　研究CKS1、CKS2調(diào)節(jié)肝癌細(xì)胞HepG2增殖與凋亡的作用與機(jī)制，為肝細(xì)胞癌臨床分子靶向治療提供新的線索。
　　方法：
　　1.CKS1、CKS2基因干擾
　　運(yùn)用RNA干擾技術(shù)，對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2進(jìn)行CKS1-siRNA、CKS2-siRNA轉(zhuǎn)染后提取細(xì)胞RNA，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）方法分別檢測(cè)CKS1、CKS2 mRNA表達(dá)水平。
　　2. CKS促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖的機(jī)

2、制研究
　　2.1p27 mRNA水平和蛋白水平檢測(cè)
　　干擾CKS1、CKS2基因表達(dá)后，應(yīng)用RT-qPCR和Western Blot技術(shù)分別檢測(cè)p27 mRNA和蛋白水平的表達(dá)。
　　2.2p27蛋白穩(wěn)定性檢測(cè)
　　干擾肝癌細(xì)胞HepG2細(xì)胞中CKS1和CKS2表達(dá)后，用CHX（放線菌酮）抑制細(xì)胞蛋白合成，運(yùn)用Western Blot技術(shù)檢測(cè)p27蛋白水平，觀察其蛋白半衰期的改變，分析CKS1、CKS2基因?qū)?/p>

3、p27蛋白穩(wěn)定性的作用。
　　2.3 p27蛋白泛素化檢測(cè)
　　通過體內(nèi)泛素化實(shí)驗(yàn)（In vivo ubiquitination）分析干擾CKS1、CKS2基因表達(dá)后對(duì)p27蛋白泛素化的影響。
　　2.4CKS與p27相互作用檢測(cè)
　　運(yùn)用免疫共沉淀的方法分析CKS1、CKS2與p27蛋白之間是否相互結(jié)合。
　　3.CKS抑制肝癌細(xì)胞凋亡的機(jī)制分析
　　3.1篩選可能相關(guān)的細(xì)胞凋亡基因。
　　3

4、.2干擾CKS1、CKS2基因表達(dá)后，應(yīng)用RT-qPCR方法檢測(cè)AIFM1等凋亡相關(guān)基因的表達(dá)水平。
　　結(jié)果：
　　1、肝癌細(xì)胞中CKS1、CKS2 RNA干擾24小時(shí)后，CKS1、CKS2 mRNA水平顯著下降（分別下降73％和63%），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　2、干擾肝癌細(xì)胞HepG2 CKS1、CKS2表達(dá)后，p27的mRNA水平?jīng)]有明顯改變，但其蛋白水平明顯上調(diào)（＞1.5倍），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　

5、　3、p27蛋白穩(wěn)定性檢測(cè)結(jié)果表明：分別干擾CKS1、CKS2基因表達(dá)后，p27蛋白半衰期和對(duì)照組相比顯著延長(zhǎng)，說明CKS1、CKS2確實(shí)參與p27蛋白水平的調(diào)控，即CKS促進(jìn)p27蛋白的降解。
　　4、體內(nèi)泛素化實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：分別干擾CKS1、CKS2基因表達(dá)后，p27蛋白的泛素化降解均受到明顯抑制。
　　5、免疫共沉淀結(jié)果顯示CKS1蛋白與p27蛋白能夠相互結(jié)合。
　　6、凋亡基因的篩選結(jié)果顯示：干擾 CKS1的表

6、達(dá)后，凋亡誘導(dǎo)因子 PMAIP1(NOXA)基因上調(diào)；干擾CKS2的表達(dá)后，凋亡抑制因子XIAP基因下調(diào)，凋亡誘導(dǎo)因子AIFM1和Bax基因上調(diào)。
　　結(jié)論：
　　1、CKS1、CKS2對(duì)p27蛋白水平的調(diào)控均是通過增強(qiáng)其泛素化降解從而促進(jìn)肝癌細(xì)胞HepG2的增殖，而與p27的mRNA水平調(diào)控?zé)o關(guān)。其中，CKS2具有促進(jìn)p27蛋白泛素化降解的作用為首次報(bào)道。
　　2、在肝癌細(xì)胞HepG2中CKS1蛋白與p27蛋白之間存