群體感應分子對白色念珠菌早期生物膜的影響.pdf

1、白色念珠菌(Candida albicans)是人類口腔內常見的條件致病真菌，生物膜是口腔白色念珠菌最常見的生存方式，在臨床感染中有重要意義。近年來許多學者發(fā)現(xiàn)群體感應與白色念珠菌生物膜形成及其穩(wěn)定的維持密切相關。farnesol(法呢醇)和tyrosol(對羥基苯乙醇)是目前已知的白色念珠菌特有的兩種群體感應分子，對前者的研究較為深入，而對后者的作用研究較少。本研究應用倒置顯微鏡和RT-PCR技術觀察了兩種群體感應分子對白色念珠菌早期

2、生物膜(90min)細胞形態(tài)以及HTA1和EFG1基因表達的調控，同時通過MTT實驗對群體感應分子對白色念珠菌早期生物膜細胞增殖的作用進行了定量分析，以期為深入研究tyrosol和farnesol的作用機制提供一定的理論依據(jù)。 第一部分群體感應分子對白色念珠菌早期生物膜細胞形態(tài)的作用　　 【材料和方法】采用含漱法獲取白色念珠菌臨床株，用RPMI1640培養(yǎng)液制備濃度為1.0×106/mL的白色念珠菌標準株和臨床株標準菌懸

3、液，5％CO2，37℃條件下以50mL培養(yǎng)瓶作為載體構建白色念珠菌早期生物膜模型。每株白色念珠菌在生物膜生長過程中，根據(jù)作用的群體感應分子不同設置三組處理組和一組對照組：(1)：100μM tyrosol(tyrosol組)；(2)：50μM farnesol(farnesol組)；(3)：50μM farnesol+500μM tyrosol(混合處理組)； (4)：無群體感應分子(對照組)。對培養(yǎng)90min后形成的白色念珠菌早期生物

4、膜在倒置顯微鏡下進行形態(tài)學觀察，同時觀察無群體感應分子作用時生長48小時的成熟生物膜。 【結果】tyrosol組和對照組早期生物膜內均以菌絲相細胞為主；farnesol組和混合處理組早期生物膜中白色念珠菌細胞主要表現(xiàn)為孢子相。培養(yǎng)48h后白色念珠菌成熟生物膜內包含了菌絲相、孢子相和假菌絲等多種形態(tài)的細胞，以菌絲相為主，同時夾雜有細胞外多聚物基質。 【結論】Tyrosol對白色念珠菌早期生物膜內細胞的菌絲形成無明顯促進作用

5、，而farnesol則對早期生物膜內細胞的菌絲形成表現(xiàn)出明顯的抑制作用；當環(huán)境中有farnesol存在時，即使高濃度的tyrosol也無法改變其對菌絲形成的抑制作用。 第二部分群體感應分子對早期生物膜內白色念珠菌HTA1和EFG1基因表達的調控 【材料和方法】將保種的白色念珠菌標準株和臨床株復蘇，用RPMI1640培養(yǎng)液制備濃度為1.0×106/mL的標準菌懸液，5％CO2，37℃條件下以50 mL培養(yǎng)瓶作為載體構建白色念

6、珠菌早期生物膜模型。每株白色念珠菌在生物膜生長過程中，根據(jù)作用的群體感應分子不同設置三組處理組和一組對照組：(1)：100μM tyrosol(tyrosol組)；(2)：50μM farnesol(farnesol組)；(3)：50μM farnesol+500μM tyrosol(混合處理組)； (4)：無群體感應分子(對照組)。用無菌細胞刮刀刮取生長90min的早期生物膜，用Trizol試劑盒提取白色念珠菌RNA后進行RT-PCR

7、測試，觀察各組組蛋白編碼基因HTA1和菌絲形成相關基因EFG1的表達是否有差異。 【結果】與對照組相比，tyrosol組白色念珠菌HTA1的表達有所增強(P<0.05)，EFG1的表達并無明顯改變(P>0.05)；farnesol組HTA1和EFGl的表達均受明顯抑制(P<0.05)；混合處理組HTA1和EFG1的表達的亦受到明顯的抑制(P<0.05)。 【結論】tyrosol能提高白色念珠菌早期生物膜內細胞HTA1的轉

8、錄水平，但對EFG1的表達無明顯促進作用，farnesol對白色念珠菌早期生物膜內細胞HTA1及EFG1均有明顯抑制作用；當tyrosol和farnesol同時作用時，前者無法改變farnesol對基因表達的下調作用，后者的作用更占優(yōu)勢。 第三部分群體感應分子對白色念珠菌早期生物膜細胞增殖的作用 【材料和方法】將保種的白色念珠菌標準株和臨床株復蘇，用RPMI1640培養(yǎng)液制備濃度為1.0x106/mL的標準菌懸液，5％C

9、O2，37℃條件下構建白色念珠菌早期生物膜模型。MTT實驗采用的生物膜構建載體為96孔細胞培養(yǎng)板，根據(jù)作用的群體感應分子不同設置三組處理組和一組對照組：(1)：100μM tyrosol(tyrosol組)；(2)：50μM famesol(famesol組)；(3)：50μM famesol+500 μM tyrosol(混合處理組)；(4)：無群體感應分子(對照組).早期生物膜形成后加入MTT溶液，繼續(xù)孵育4h，翻轉培養(yǎng)板棄去孔內液

10、體，加入DMSO，振蕩10min，用酶標儀測定490nm處吸光度值(OD490)，比較不同群體感應分子處理對白色念珠菌早期生物膜細胞增殖生長的影響。 【結果】與對照組相比，tyrosol組白色念珠菌早期生物膜內細胞數(shù)量無明顯差異(P>0.05)，而famesol組和混合處理組生物膜內細胞增殖卻受到明顯抑制(P<0.05)。 【結論】tyrosol對白色念珠菌早期生物膜細胞增殖無顯著促進作用；famesol能夠抑制白色念珠