理氣開郁中藥利膽作用與柴郁湯利膽機(jī)制研究.pdf

1、目的：本實(shí)驗(yàn)通過觀察柴郁湯，芍甘湯和痛瀉要方在ANIT造成的大鼠肝內(nèi)膽汁淤積模型上的利膽作用以及采用血清藥理學(xué)的方法探討柴郁湯對CCl4造成的大鼠原代肝細(xì)胞急性損傷的保護(hù)作用，證實(shí)了柴郁湯對實(shí)驗(yàn)性大鼠體內(nèi)外的利膽作用，為臨床用藥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法：實(shí)驗(yàn)一觀察三種中藥復(fù)方對ANIT造成的大鼠肝內(nèi)膽汁淤積的利膽作用：健康Wistar大鼠96只分為12組：正常對照組，膽汁淤積模型組(簡稱模型組)，柴郁湯低、中、高劑量組，芍甘湯低、中

2、、高劑量組，痛瀉要方低、中、高劑量組和熊去氧膽酸組。第1天對大鼠進(jìn)行膽管插管，第2天早上正常對照組灌胃食用豆油，其余組灌胃4％ANIT，第4天早上各組均收集1小時(shí)膽汁；然后除正常對照組灌胃蒸餾水外其余各組灌胃相應(yīng)的藥物，晚上再灌胃1次，灌胃1小時(shí)后收集1小時(shí)膽汁。第5天早晚各灌胃1次，晚上灌胃1小時(shí)后收集1小時(shí)膽汁。 實(shí)驗(yàn)二大鼠肝細(xì)胞原代培養(yǎng)方法的建立：健康雄性Wistar大鼠每次1只，麻醉開腹，暴露肝門靜脈和下腔靜脈，用留置針

3、插入門靜脈，同時(shí)剪斷下腔靜脈。向門靜脈內(nèi)灌注39℃預(yù)熱的無鈣灌流液，直至肝呈灰白色，然后灌注39℃預(yù)熱的0.025％的Ⅱ型膠原酶直至肝臟變成土黃色，將肝臟轉(zhuǎn)移至盛有含5％血清的RPMI1640培養(yǎng)液的燒杯中，用無菌眼科鑷子不斷抖動(dòng)肝臟，肝細(xì)胞散落于培養(yǎng)液中而成肝細(xì)胞懸液。將盛有細(xì)胞懸液的燒杯置于37℃水浴振蕩15min，再置于冰水中冷卻10min。用200目篩網(wǎng)過濾，濾液收集在50ml塑料離心管中，50g/min，2min，離心3次，末

4、次棄上清后用生長培養(yǎng)液重懸細(xì)胞。對細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察及測繪生長曲線。 實(shí)驗(yàn)三大鼠藥物血清的制備：體重(200±20)g的wistar大鼠10只，雌雄各半，設(shè)正常血清對照組(蒸餾水)，柴郁湯高、中、低劑量組，陽性藥物組(熊去氧膽酸片)。每天灌胃2次，連續(xù)3d。最后1次灌胃1h后下腔靜脈采血，3000r/min離心15min，取血清-20℃冰箱保存。柴郁湯對CCl4造成的大鼠原代肝細(xì)胞急性損傷的保護(hù)作用：將密度為4×104/ml的原

5、代肝細(xì)胞種于24孔及96孔培養(yǎng)板中，37℃、5％CO2孵育箱中培養(yǎng)48h后，分為正常血清對照組(加入正常大鼠血清)，模型組，柴郁湯高、中、低劑量組(加入相應(yīng)劑量的藥物血清)以及陽性藥物組(加入熊去氧膽酸藥物血清)(每組設(shè)6復(fù)孔)，繼續(xù)培養(yǎng)6h，18h，30h后除正常血清對照組外均加入10mmol/LCCl4，繼續(xù)作用6h測定MTT，分別收集這三個(gè)時(shí)間點(diǎn)的培養(yǎng)上清液以測定丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、甘膽酸(CG)，并收集細(xì)胞測定細(xì)胞膜Na

6、+-K+-ATP酶活性。 結(jié)果：實(shí)驗(yàn)一三種中藥復(fù)方給藥后第2天與給藥前比較膽汁均增多，差異有顯著性意義。 實(shí)驗(yàn)二根據(jù)Berry的膠原酶消化法并結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室條件成功進(jìn)行肝細(xì)胞分離，得率3×107個(gè)，存活率90％以上。 實(shí)驗(yàn)三成功制備正常大鼠血清、柴郁湯低劑量藥物血清、柴郁湯中劑量藥物血清、柴郁湯高劑量藥物血清以及陽性藥物血清。隨柴郁湯用量增加，柴郁湯藥物血清使CCl4損傷大鼠肝細(xì)胞培養(yǎng)上清中ALT的含量下降，而上清