理氣開郁法板塊方的抗炎作用及其機(jī)理研究.pdf

1、目的：本實(shí)驗(yàn)通過觀察金鈴子散、痛瀉要方、芍藥甘草湯、柴郁湯四種中藥復(fù)方制劑的抗炎作用以及采用血清藥理學(xué)的方法探討四種中藥制劑對(duì)致炎的中性多形核白細(xì)胞(polymorphonuclear leukocytes，PMN)的抗炎作用，用以證實(shí)四種中藥制劑對(duì)實(shí)驗(yàn)性大鼠體內(nèi)外的抗炎作用，為其研發(fā)和臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法： 實(shí)驗(yàn)一 觀察四種中藥復(fù)方制劑對(duì)1％角叉菜膠引起的大鼠足腫脹的抑制作用：清潔級(jí)Wistar大鼠153只按體

2、重進(jìn)行隨機(jī)區(qū)組分組，分為15組：正常組，模型組，氫化可的松組，金鈴子散低、中、高劑量組，痛瀉要方低、中、高劑量組，芍藥甘草湯低、中、高劑量組，柴郁湯低、中、高劑量組。第一天對(duì)大鼠稱重，編號(hào)，分組，第二天、第三天用改良的鼠足容積測(cè)定器測(cè)定正常狀態(tài)下，大鼠右后足趾的容積，第四天早上正常組灌胃蒸餾水，模型組灌胃蒸餾水，氫化可的松組灌胃氫化可的松溶液，四種中藥復(fù)方制劑低、中、高劑量組分別灌胃對(duì)應(yīng)的低、中、高劑量的四種中藥復(fù)方制劑。第五天至第九天

3、灌胃給藥，劑量同第四天，第九天灌胃給藥后，將大鼠右后肢拉直，用1 ml注射器先自足趾中部皮下向上注入一部分1％角叉菜膠溶液，然后掉轉(zhuǎn)頭向下注完，每只0.1ml，正常組除外。分別于注入前及注入后0.5h、1 h、2 h、4 h、6 h，測(cè)定大鼠右后致炎足腫脹程度(容積)。 實(shí)驗(yàn)二 觀察四種中藥復(fù)方制劑對(duì)巴豆油混合致炎劑引起的小鼠耳腫脹的抑制作用：清潔級(jí)昆明種小鼠150只，按體重進(jìn)行隨機(jī)區(qū)組分組，分為15組：模型組，氫化可的松組，阿

4、司匹林組，金鈴子散低、中、高劑量組，痛瀉要方低、中、高劑量組，芍藥甘草湯低、中、高劑量組，柴郁湯低、中、高劑量組。第一天對(duì)小鼠稱重，編號(hào)，分組，第一天下午模型組灌胃蒸餾水，氫化可的松組灌胃氫化可的松溶液，阿司匹林組灌胃阿司匹林混懸液，四種中藥復(fù)方制劑低、中、高劑量組分別灌胃對(duì)應(yīng)的低、中、高劑量的四種中藥復(fù)方制劑。第二天至第五天灌胃給藥，劑量同第一天，最后一次灌胃lh后，在小鼠右耳正反面均勻涂抹2％的巴豆油混合致炎劑50μl，左耳不做任何

5、處理。4h后，測(cè)定小鼠右耳腫脹度。 實(shí)驗(yàn)三 觀察四種中藥復(fù)方制劑對(duì)1％角叉菜膠引起的大鼠氣囊炎性液中炎性介質(zhì)的抑制作用：清潔級(jí)Wistar大鼠150只，按體重進(jìn)行隨機(jī)區(qū)組分組，分為15組：正常組，模型組，金鈴子散低、中、高劑量組，痛瀉要方低、中、高劑量組，芍藥甘草湯低、中、高劑量組，柴郁湯低、中、高劑量組和氫化可的松組。第一天對(duì)大鼠稱重，編號(hào)，分組，第二天、第三天用剃毛器給大鼠背部剃毛，第三天背部皮下注射空氣20 ml(事先經(jīng)0

6、.2μm過濾器濾過)，制作氣囊。第四天早上正常組灌胃蒸餾水，模型組灌胃蒸餾水，氫化可的松組灌胃氫化可的松溶液，四種中藥復(fù)方制劑低、中、高劑量組分別灌胃對(duì)應(yīng)的低、中、高劑量的四種中藥復(fù)方制劑，第五天、第八天分別給大鼠背部皮下再次注射10 ml的空氣以維持氣囊的膨脹，第五天至第九天灌胃給藥，劑量同第四天，第九天灌胃給藥后1h，向大鼠氣囊內(nèi)注入1％角叉菜膠溶液每只2 ml，正常組除外。6h后腹腔靜脈采血和從氣囊中取炎性滲出液。測(cè)定血清皮質(zhì)醇含

7、量，測(cè)定炎性滲出液中前列腺素E<,2>(prostaglandin E<,2>，PGE<,2>)、一氧化氮(nitric oxide，NO)、白細(xì)胞介素-6(interleukin，IL-6)的含量。 實(shí)驗(yàn)四 探討四種中藥復(fù)方制備的藥物血清對(duì)中性多形核白細(xì)胞的抑制作用：將1％的角叉菜膠混懸液1 ml通過肋骨間隙注入大鼠右側(cè)胸腔內(nèi)4 h后，處死動(dòng)物，用冷鹽水5ml兩次沖洗胸腔，收集PMNs，一部分作白細(xì)胞計(jì)數(shù)，900g，5min離

8、心后，棄上清液，加入冷的0.87％氯化銨溶液5ml，使紅細(xì)胞溶解，剩下的均為PMNs。用磷酸鹽緩沖液PBS洗兩次，懸浮細(xì)胞，用臺(tái)盼藍(lán)拒染法做活力測(cè)定，活細(xì)胞超過95％，用RPIM1640培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜，用RPMI1640洗細(xì)胞兩次，1500r/min離心，每10 ml細(xì)胞懸液中加入200μl谷氨酰胺，以調(diào)細(xì)胞濃度至3.5×10<'5>/ml。將3.5×10<'5>/ml多形核白細(xì)胞接種于2塊96孔培養(yǎng)板中，每孔100μl，同時(shí)設(shè)RPMI

9、1640培養(yǎng)液對(duì)照組，不加PMNs，只加RPMI1640培養(yǎng)液150μl(空白組)，分別設(shè)四種中藥復(fù)方制備的藥物血清組，金鈴子散高劑量組(金鈴子散組)，痛瀉要方高劑量組(痛瀉方組)，芍藥甘草湯高劑量組(芍甘湯組)，柴郁湯高劑量組(柴郁湯組)，正常大鼠血清組(正常組)，PBS組，延胡索乙素標(biāo)準(zhǔn)品低劑量組(延胡索乙素低組)，延胡索乙素標(biāo)準(zhǔn)品中劑量組(延胡索乙素中組)，延胡索乙素標(biāo)準(zhǔn)品高劑量組(延胡索乙素高組)，芍藥苷標(biāo)準(zhǔn)品低劑量組(芍藥苷低

10、組)，芍藥苷標(biāo)準(zhǔn)品中劑量組(芍藥苷中組)，芍藥苷標(biāo)準(zhǔn)品高劑量組(芍藥苷高組)，姜黃素標(biāo)準(zhǔn)品低劑量組(姜黃素低組)，姜黃素標(biāo)準(zhǔn)品中劑量組(姜黃素中組)，姜黃素標(biāo)準(zhǔn)品高劑量組(姜黃素高組)，氫化可的松組。每孔中均加入藥物血清或PBS或標(biāo)準(zhǔn)品溶液50μl。37℃、5％CO<,2>孵育箱中預(yù)培養(yǎng)24h。測(cè)定時(shí)，向每孔中加入20μlluminol發(fā)光劑，最后每孔中加入150μl酵母多糖應(yīng)用液置入發(fā)光測(cè)定儀，測(cè)其發(fā)光強(qiáng)度。 結(jié)果：

11、實(shí)驗(yàn)一 四種中藥復(fù)方制劑在角叉菜膠引起足腫脹4h時(shí)抑制作用最強(qiáng)。 實(shí)驗(yàn)二 低、中、高劑量的金鈴子散與中、高劑量的芍藥甘草湯均能明顯抑制巴豆油混合致炎劑起的小鼠耳腫脹，而痛瀉要方和柴郁湯對(duì)耳腫脹的抑制作用較弱。 實(shí)驗(yàn)三 金鈴子散和芍藥甘草湯對(duì)大鼠氣囊炎性液中PGE<,2>有顯著抑制作用。金鈴子散、痛瀉要方、芍藥甘草湯和柴郁湯對(duì)大鼠氣囊炎性液中白細(xì)胞介素-6有顯著抑制作用。金鈴子散、痛瀉要方、芍藥甘草湯和柴郁湯對(duì)大鼠氣囊炎性

12、液中一氧化氮有明顯抑制作用。 實(shí)驗(yàn)四 金鈴子散藥物血清、痛瀉要方藥物血清、芍藥甘草湯藥物血清、延胡索乙素(10<'-5>-10<'-3>3mol/L)、芍藥苷(10<'-5>-10<'-3>mol/L)和姜黃素(10<'-5>-10<'-3>mol/L)對(duì)中性多形核白細(xì)胞具有顯著抑制作用。 結(jié)論： 1．金鈴子散、痛瀉要方、芍藥甘草湯和柴郁湯在體內(nèi)外均有明顯的抗炎作用。 2．金鈴子散、痛瀉要方、芍藥甘草湯對(duì)