星形膠質(zhì)細(xì)胞調(diào)控的神經(jīng)干細(xì)胞分化及其對(duì)脊髓損傷的修復(fù)作用.pdf

1、脊髓損傷(Spinalcordinjury，SCI)的修復(fù)研究是神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域的難點(diǎn)和熱點(diǎn)問題。傳統(tǒng)觀念認(rèn)為，成年哺乳動(dòng)物的神經(jīng)元不能進(jìn)行有絲分裂，SCI后軸突也幾乎不能再生，因此，導(dǎo)致永久性和不可逆轉(zhuǎn)的運(yùn)動(dòng)和感覺功能障礙。但近年來，神經(jīng)干細(xì)胞(Neuralstemcell，NSC)的發(fā)現(xiàn)打破了這種傳統(tǒng)的“定論”。 NSC具有自我復(fù)制和多向分化潛能，作為修復(fù)SCI的供體不但能滿足移植時(shí)所需的細(xì)胞量，而且在一定條件下能分化為神經(jīng)元、

2、星形膠質(zhì)細(xì)胞(Astrocyte，AS)和少突膠質(zhì)細(xì)胞，可以替代受損或死亡神經(jīng)元的部分功能，同時(shí)分泌多種神經(jīng)營養(yǎng)因子，保護(hù)脊髓神經(jīng)元，促進(jìn)損傷組織的結(jié)構(gòu)和功能修復(fù)，為治療SCI帶來了新的希望。 然而，進(jìn)一步研究表明，將NSC移植到損傷脊髓后，雖然可在宿主體內(nèi)存活、分化，并在一定程度上恢復(fù)機(jī)體功能，但移植的NSC95％以上分化為膠質(zhì)細(xì)胞，神經(jīng)元數(shù)量極少，難以與宿主之間形成有效的突觸聯(lián)系。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)某些外源性細(xì)胞因子如：BDNF、

3、PDGF、FGF、TGF-β等可調(diào)控NSC向神經(jīng)元分化，在體外條件下提高分化神經(jīng)元的比例。但體內(nèi)移植時(shí)，細(xì)胞因子將隨著NSC的分化而逐漸耗竭，同時(shí)受局部微環(huán)境多種因素影響，生物活性也會(huì)減弱，不能長期有效地維持作用濃度，限制了NSC在體的治療效果。NSC的分化調(diào)控成為目前神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域的重要研究方向。 AS是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中數(shù)目占絕對(duì)優(yōu)勢的一類膠質(zhì)細(xì)胞，可以分泌GDNF、NGF、BDNF、NT、CNTF等多種神經(jīng)營養(yǎng)因子以及EGF、F

4、GF、細(xì)胞粘附分子等細(xì)胞生長因子，不僅能促進(jìn)神經(jīng)元的存活、生長以及遷移，而且能夠通過上述細(xì)胞因子調(diào)控NSC分化，在神經(jīng)系統(tǒng)的整個(gè)發(fā)育及損傷修復(fù)過程中起著不可替代的重要作用。研究表明不同類型的AS即：原漿型星形膠質(zhì)細(xì)胞(Protoplasmicastrocyte，PAS)和纖維型星形膠質(zhì)細(xì)胞(Fibrousastrocyte，F(xiàn)AS)在形態(tài)結(jié)構(gòu)以及上述生物學(xué)功能上存在一定差異。因此，不同類型的AS可能對(duì)NSC分化具有不同作用。而這種細(xì)胞間

5、的調(diào)控作用可以克服外源性細(xì)胞因子調(diào)控存在的不足：細(xì)胞因子單一，給藥方式受限、有效濃度衰減快、生物活性容易減弱等。同時(shí)這種細(xì)胞調(diào)控方式還具有受局部損傷微環(huán)境影響小、容易實(shí)現(xiàn)體內(nèi)調(diào)節(jié)等優(yōu)點(diǎn)。為此，本研究課題首先從E13～E14天大鼠的脊髓和新生2天大鼠皮層中分離、培養(yǎng)NSC和兩類AS，并進(jìn)行純化和鑒定。然后離體觀察兩種AS作為飼養(yǎng)細(xì)胞對(duì)NSC分化調(diào)控作用的差異，篩選出有利于調(diào)控NSC向神經(jīng)元分化的AS，并進(jìn)一步研究該AS與NSC在不同比例下

6、的調(diào)控效果。最后按照最佳比例進(jìn)行細(xì)胞聯(lián)合移植，治療脊髓損傷，通過病理學(xué)、免疫組織化學(xué)、神經(jīng)示蹤、電生理學(xué)以及行為學(xué)等技術(shù)手段，觀察AS調(diào)控的NSC在體分化情況及其對(duì)損傷脊髓結(jié)構(gòu)和功能的修復(fù)作用，并初步探討其機(jī)制。主要的研究結(jié)果和結(jié)論如下：1.從胚胎脊髓中成功分離出NSC，脊髓NSC在bFGF作用下，能夠較好地保持自我增殖能力；并且在一定誘導(dǎo)條件下，能夠分化為三種不同的細(xì)胞系即：神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞。 2.通過差速振

7、蕩法進(jìn)行分離培養(yǎng)，可成功獲得PAS和FAS，純度達(dá)95％以上。 3.PAS和FAS分別作為飼養(yǎng)細(xì)胞與NSC共培養(yǎng)，采用免疫組織化學(xué)方法觀察到：PAS調(diào)控NSC分化為神經(jīng)元的比例(61％)明顯高于FAS(41％)。表明PAS更有利于誘導(dǎo)NSC向神經(jīng)元分化。 4.在離體細(xì)胞共培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)中，細(xì)胞的比例不同NSC分化存在差異，其中NSC：PAS為2：1時(shí)NSC分化為神經(jīng)元的比例最高。 5.PAS調(diào)控NSC分化的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證

8、實(shí)：以2：1聯(lián)合PAS移植的NSC在損傷脊髓微環(huán)境中分化神經(jīng)元數(shù)量明顯高于單純NSC移植。 6.細(xì)胞聯(lián)合移植治療SCI，形態(tài)學(xué)研究觀察到：移植細(xì)胞能夠在脊髓損傷的微環(huán)境中存活和分化，并可在8周封閉空洞，填充缺損，與正常部位脊髓形成纖維聯(lián)系；細(xì)胞聯(lián)合移植較單純NSC移植和PAS移植的運(yùn)動(dòng)終板形態(tài)結(jié)構(gòu)更為完整，提示聯(lián)合移植NSC和PAS(2：1)能更好地修復(fù)中樞與外周的纖維聯(lián)系，對(duì)損傷脊髓有更好的結(jié)構(gòu)修復(fù)作用。 7.細(xì)胞聯(lián)合