黃芪多糖對(duì)脊髓損傷及神經(jīng)干細(xì)胞增殖分化的影響.pdf

1、目的：
　　本實(shí)驗(yàn)主要通過(guò)APS干預(yù)大鼠SCI，觀察其神經(jīng)功能恢復(fù)相關(guān)指標(biāo)，篩選最佳劑量。其次將APS單體應(yīng)用于NSC體外培養(yǎng)，觀察NSC增殖分化的影響。再比較APS單體及APS含藥血清對(duì)NSC增殖分化影響，對(duì)比相關(guān)評(píng)判指標(biāo)的變化，探求APS影響神經(jīng)修復(fù)及NSC增殖分化作用機(jī)制。
　　方法：
　　1.APS對(duì)大鼠SCI神經(jīng)功能變化的影響
　　清潔級(jí)SD大鼠80只，體重195-200g，制取大鼠脊髓半切模型后，完全

2、隨機(jī)分為4組：生理鹽水（ NS）-10ml/kg，低劑量組（ APS-5ml/kg）、中劑量組(APS-10ml/kg)和高劑量組（APS-15ml/kg），分別每日相同時(shí)間注射相關(guān)藥物，連續(xù)注射14天。測(cè)定雙盲BBB評(píng)分，血液中MDA和SOD含量、誘發(fā)電位、HE染色組織病理學(xué)切片變化。Elisa方法檢測(cè)組織中NGF、VEGF、TNF-ɑ、IL-1含量變化情況，Western Blot法檢測(cè)ASK1、P38、P-P38蛋白表達(dá)。

3、　　2.不同劑量APS與NSC增殖分化的關(guān)系
　　2-3傳代神經(jīng)干細(xì)胞，臺(tái)盼蘭細(xì)胞染色后，鏡下細(xì)胞計(jì)數(shù)后，每孔(20孔)細(xì)胞數(shù)約為1×109個(gè)，完全隨機(jī)分組，(1)對(duì)照組（PBS組）（2）陽(yáng)性對(duì)照組（BDNF組）（3）2.5％ APS組(4)5% APS組（5)7.5%APS組，與相應(yīng)濃度黃芪多糖共同培養(yǎng)3-14天,多次實(shí)驗(yàn)，數(shù)據(jù)取平均值。采用間接免疫熒光法檢測(cè)Nestin，β-tubulinⅢ和 GFAP，通過(guò)CCK-8檢測(cè)細(xì)胞

4、增殖，Elisa檢測(cè)NGF、VEGF含量，Western Blot法檢測(cè)ERK和突觸素P38表達(dá)。
　　3.APS單體及含藥血清與NSC增殖分化的關(guān)系
　　參考前期APS劑量實(shí)驗(yàn)結(jié)果，制取APS含藥血清，56℃滅活30min，220nm濾膜濾過(guò)除菌，-20℃保存?zhèn)溆谩?-3傳代生長(zhǎng)情況良好的NSC球，加臺(tái)盼蘭進(jìn)行細(xì)胞染色，細(xì)胞計(jì)數(shù)每孔約為1×109個(gè)，完全隨機(jī)分組：(1)空白對(duì)照組（PBS組）（2）空白血清組（PBS血清組

5、）（3） APS組(4)APS含藥血清（同等劑量），并加入相應(yīng)藥物培養(yǎng)3-14天。采用間接免疫熒光法檢測(cè)Nestin，β-tubulinⅢ和 GFAP，通過(guò)CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖，Elisa檢測(cè)VEGF,Western Blot法檢測(cè)PI3K、P-Akt和突觸素p38表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1.APS高中低三個(gè)劑量組干預(yù)大鼠SCI,各組大鼠均出現(xiàn)體重下降，BBB評(píng)分提高,且與時(shí)間呈正相關(guān)，藥物組與對(duì)照組有明顯差異（P＜0.0

6、5）。血液中MAD濃度降低，SOD活性提高，有效縮短誘發(fā)電位MEP、SEP N1波峰潛時(shí)，并穩(wěn)定波幅，利用ELISA檢測(cè)發(fā)現(xiàn)血液中NGF、VEGF含量增加，而降低TNF-ɑ、IL-1含量減少。Western Blot結(jié)果顯示ASK1、P38、P-P38蛋白表達(dá)水平下降。HE染色顯示，藥物組神經(jīng)纖維分布和膠質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)上優(yōu)于對(duì)照組，且壞死囊及空泡量明顯減少，其中中劑量效果最佳。
　　2.APS干預(yù)NSC后，NESTIN陽(yáng)性說(shuō)明所培養(yǎng)的

7、細(xì)胞為NSC，CCK-8、Brdu結(jié)果提示APS可促進(jìn)NSC增殖，并提高NSE、降低GFAP陽(yáng)性細(xì)胞百分比數(shù)值，可增加VEGF、NGF含量，同時(shí)增強(qiáng)ERK和突觸素P38蛋白表達(dá)水平，且藥物組與對(duì)照組有明顯差異（P＜0.05），最佳劑量為5%。
　　3.APS單體及APS含藥血清干預(yù)NSC，NESTIN陽(yáng)性說(shuō)明所培養(yǎng)的細(xì)胞為NSC，CCK-8、Brdu提示兩者均可促進(jìn)NSC增殖，并提高NSE，降低GFAP陽(yáng)性細(xì)胞百分比數(shù)值，但兩者在

8、細(xì)胞增殖和定向誘導(dǎo)向NSE分化有明顯差異（P＜0.05），APS含藥血清在提高VEGF含量、PI3K、P-Akt和突觸素p38蛋白表達(dá)上效果更好。
　　結(jié)論：
　　1.中劑量APS時(shí)對(duì)大鼠SCI神經(jīng)功能的恢復(fù)效果最佳。其可能通過(guò)抗氧化，緩解SCI脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，同時(shí)調(diào)節(jié)血液中NGF、VEGF、TNF-ɑ、IL-1含量，活化P38 MAPK通路，抑制炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡，促進(jìn)神經(jīng)纖維增生和神經(jīng)傳導(dǎo)功能恢復(fù)。
　　2.APS

9、濃度為5%時(shí)對(duì)NSC增殖分化效果最佳，可能通過(guò)調(diào)節(jié)VEGF、NGF含量及ERK蛋白，激活相關(guān)信號(hào)通路，活化下游靶基因，發(fā)揮多種生物學(xué)效應(yīng)促進(jìn)NSC增殖，并提高突觸素p38蛋白表達(dá)，促進(jìn)NSC向NSE方向分化。
　　3.APS含藥血清對(duì)NSC增殖分化效果優(yōu)于APS單體，可能通過(guò)調(diào)節(jié)VEGF含量，活化PI3K/Akt信號(hào)通路，促進(jìn)Akt磷酸化，激活下游靶基因及相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子，促進(jìn)NSC增殖。VEGF還可以影響鈣離子通道，提高突觸素p38