不同來源成體神經(jīng)干細(xì)胞對大鼠脊髓損傷修復(fù)作用的實驗研究.pdf

1、本課題以應(yīng)用性研究為目的，選取來源于同一SD大鼠成體中骨髓、脂肪和腦室下區(qū)（陽性對照）三個部位的組織，體外分離、誘導(dǎo)分化為不同組織來源的NSCs，并比較各組NSCs體外自我更新的能力；以流式細(xì)胞儀等方法檢測細(xì)胞表型標(biāo)記物、鑒定BMSCs和ADSCs，并通過細(xì)胞周期檢測比較兩者增殖分化潛能；通過免疫細(xì)胞化學(xué)檢測三組細(xì)胞不同階段β-微管蛋白（β-tubulin）、神經(jīng)膠質(zhì)纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic prot

2、ein，GFAP）、半乳糖腦苷脂C（galactocerebroside C，GalC）表達情況；ELISA法定量檢測體外培養(yǎng)各組NSCs的腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（brain derived neuronutrophic，BDNF）和神．經(jīng)生長因子（nerve growth factor，NGF）等神經(jīng)營養(yǎng)因子的分泌水平。 第一部分：不同來源成體神經(jīng)干細(xì)胞的獲取及相關(guān)生物學(xué)特性比較 目的：體外分別誘導(dǎo)分化來源于同一SD大鼠成

3、體骨髓、脂肪和大腦三種組織的NSCs，比較和評價它們在體外自我更新、向神經(jīng)元或神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞分化的能力，通過對比三者體外分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子的能力，進一步評估和對比它們移植修復(fù)脊髓損傷的潛能。 方法：選取來源于同一SD大鼠成體骨髓、脂肪和腦室下區(qū)（陽性對照）三個部位的組織，體外分別誘導(dǎo)分化為骨髓源性神經(jīng)干細(xì)胞（bone marrow stromal cell-derived neural stem cells，BM-NSCs）、脂肪源

4、性神經(jīng)干細(xì)胞（adipose tissue stromal cells-derived neural stem cells，AD-NSCs）和腦室下區(qū)源性神經(jīng)干細(xì)胞（subventricularzone-derived neural stem cells，SVZ-NSCs），比較三組NSCs的自我更新和分化情況；流式細(xì)胞儀檢測CD29、CD34、CD43和CD90等細(xì)胞表型標(biāo)記物的表達，鑒定BM-NSCs和AD-NSCs的分化情況，并通

5、過細(xì)胞周期檢測比較兩者的體外增殖潛能；應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測巢蛋白（Nestin）、β-tubulin、GFAP和GalC四種細(xì)胞表面標(biāo)記物的表達；并用Western blot方法進一步驗證免疫細(xì)胞化學(xué)的結(jié)果，比較和評價它們向神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞分化、增殖的能力；ELISA法定量檢測體外培養(yǎng)三種組織來源NSCs的BDNF和NGF等神經(jīng)營養(yǎng)因子蛋白水平，通過對比三者分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子的能力進一步評估它們移植修復(fù)脊髓挫傷的潛能，為SCI損傷臨床

6、干細(xì)胞移植治療尋求適合的種子細(xì)胞提供體外實驗數(shù)據(jù)。 結(jié)果：三種組織來源基質(zhì)細(xì)胞形成的神經(jīng)球（即NSCs球，neurosphere）從外形觀察無明顯差異；但體外擴增率BM-NSCs和AD-NSCs不如SVZ-NSCs，觀察到第20天，AD-NSCs（52．40±8．53）和BM-NSCs（35．60±6．54）神經(jīng)球的倍增數(shù)目都顯著低于SVZ-NSCs（83．80±8．10），而AD-NSCs要高于BM-NSCs；神經(jīng)球形成階段，

7、SVZ-NSCs組的Nestin陽性率（84．41±6．18）明顯高于BM-NSCs組（69．18±7．33）和AD-NSCs組（74．24±5．86）；相比之下，AD-NSCs組又要高于BM-NSCs組；神經(jīng)球分化后，三組細(xì)胞Nestin陽性表達都明顯下降，分別為28．32±2．89、31．30±2．76和31．18±4．04。無論在神經(jīng)球形成還是分化階段，免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果均顯示，BM-NSCs組（2．06±0．75和28．22±6．

8、41）和AD-NSCs組（1．10±0．50和26．82±4．87）β-tubulin表達陽性率均低于SVZ-NSs組（14．00±3．18和36．28±3．66），GFAP、GalC表達各組間表達無差異。由此提示，BM-NSCs和AD-NSCs體外向神經(jīng)元分化的潛能低于SVZ-NSCs，而體外向膠質(zhì)細(xì)胞分化的能力三組無差異，Western blot在蛋白水平也支持這一結(jié)果。同時，ELISA檢測結(jié)果表明，三組細(xì)胞都能檢測出BDNF和NG

9、F分泌，但BM-NSCs組（22．82±4．43和44．96±8．81）和AD-NSCs組（45．78±8．82和62．38±13．99）明顯低于SVZ-NSCs組（103．85±8．28和117．64±14．85）；BM-NSCs組和AD-NSCs組相比較，盡管兩組的營養(yǎng)因子分泌水平無統(tǒng)計學(xué)差異，但仍可看出AD-NSCs組BDNF和NGF的水平均高于BM-NSCs組。 結(jié)論：體外實驗證實，BM-NSCs和AD-NSCs與SVZ

10、-NSCs一樣都具有向神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞分化的潛能，都能夠分泌SCI修復(fù)所必需的神經(jīng)營養(yǎng)因子。雖然三種不同組織來源的神經(jīng)球從外形觀察無差異，但無論在增殖能力、向神經(jīng)細(xì)胞終極分化的能力和分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子的能力等方面，BM-NSCs和AD-NSCs均遜于中樞神經(jīng)組織來源的SVZ-NSCs； BM-NSCs與AD-NSCs之間比較，又以后者具較明顯優(yōu)勢。 第二部分：不同來源成體神經(jīng)干細(xì)胞移體內(nèi)植修復(fù)大鼠脊髓損傷作用的比較 目

11、的：在體外實驗的基礎(chǔ)上，體內(nèi)移植BrdU標(biāo)記的各組NSCs，觀測它們對自由落體SCI模型大鼠的修復(fù)作用，進一步評價和比較三種組織來源的NSCs對大鼠SCI的治療效果，為SCI損傷的臨床干細(xì)胞移植治療尋求適合的種子細(xì)胞提供體內(nèi)實驗數(shù)據(jù)。 方法：選取來源于同一SD大鼠成體中骨髓、脂肪和大腦（陽性對照）的三個部位的組織，誘導(dǎo)分化為不同組織來源的NSCs。移植前，將BrdU以10μmol/L終濃度加入培養(yǎng)液中，以標(biāo)記各組待移植的干細(xì)胞；

12、100只成年SD大鼠應(yīng)用自由落體損傷模型裝置獲得脊柱損傷，模型制備成功1周后，采用完全隨機數(shù)字表法分成5組：SVZ-NSs組、AD-NSs組、BM-NSs組、生理鹽水組每組24只，假手術(shù)對照組4只，取各組標(biāo)記好的NSCs（濃度為107個/ml）60ul，通過立體定位手術(shù)分別移植入大鼠SCI部位，于移植后不同時間點通過BBB評分比較修復(fù)SCI功能的效果；術(shù)后8周，計算各組脊髓空洞率；免疫組織化學(xué)檢測各組NSCs在體內(nèi)向神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞分化

13、的情況。 結(jié)果：與生理鹽水對照組比較，三種不同組織來源NSCs處理組BBB評分在2～8周表現(xiàn)出早期增值，9周以后的評分增值明顯。移植后1周，免疫組化檢測示各組SCI組織都能檢測到β-tubulin、GFAP和GalC陽性表達細(xì)胞，提示各組都有不同比例的干細(xì)胞向神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞分化。雖然各組之間Brdu/β-tubulin+、 BrdU/GFAP+和BrdU/GalC+雙標(biāo)記細(xì)胞數(shù)差異均不大，無統(tǒng)計學(xué)差異，但從實驗結(jié)果圖片上可

14、以看出，SVZ-NSCs組三種陽性細(xì)胞的比例（分別為1．31±1．10、1．12±0．93和53．24±6．27）都略高于AD-NSs組（分別為0．59±0．38、0．87±0．35和48．20±5．70）和BM-NSs組（分別為0．61±0．33、0．60±0．44和50．70±5．59）；到術(shù)后8周，各組均只檢測到少量Brdu/β-tubulin+和BrdU/GFAP+細(xì)胞。檢測5組大鼠移植術(shù)后8周脊髓空洞大小，AD-NSs組（6．

15、76±1．93）和BM-NSs組（7．10±1．33）與生理鹽水（13．40±2．14）對照組和SVZ-NSCs組（10．86±2．64）相比，空洞率有明顯的減少；而盡管SVZ-NSCs組取得明顯功能恢復(fù)，但空洞率與生理鹽水對照組相比沒有明顯差異。 結(jié)論：植入來源于成體大鼠骨髓和脂肪組織來源的NSCs與來源于大腦的NSCs一樣都可以在一定程度上提高SCI后運動功能恢復(fù)，SVZ-NSCs治療組作為神經(jīng)組織源NSCs增殖分化及移植治

16、療SCI的陽性對照組，SCI大鼠運動功能恢復(fù)要比其他處理組療效顯著。移植到體內(nèi)后，AD-NSs、BM-NSs和SVZ-NSCs都有不同比例的細(xì)胞向神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞分化。雖然免疫組化陽性細(xì)胞計數(shù)方面各組沒有統(tǒng)計學(xué)差異，但是由實驗結(jié)果可以提示，AD-NSs組和BM-NSs組細(xì)胞在體內(nèi)向神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞分化的能力仍略低于SVZ-NSCs組。移植術(shù)后8周，以脊髓空洞率檢測脊髓修復(fù)情況，結(jié)果卻顯示AD-NSs組（6．76±1．9

17、3）和BM-NSs組（7．10±1．33）均優(yōu)于SVZ-NSCs組（10．86±2．64）。提示SCI后的大體組織結(jié)構(gòu)修復(fù)情況（空洞率變化）和功能修復(fù)之間沒有必然聯(lián)系，細(xì)胞橋架作用可能不是功能修復(fù)的主要機制。 全文小結(jié)：本課題的體外實驗及體內(nèi)實驗結(jié)果均表明，來源于成體骨髓和脂肪的NSCs，與來源于腦組織（陽性對照）的NSCs一樣，均可作為移植用種子細(xì)胞對脊髓損傷發(fā)揮修復(fù)作用，雖然腦源性NSCs比骨髓源性和脂肪源性NSCs具有更強