BRCA1-2基因與Eμ-Myc p19Arf---細胞藥物敏感性及其表達在乳腺癌中的臨床意義.pdf

1、DNA損傷修復是細胞對外界損傷的主要防御體系，對維持基因組的完整性至關(guān)重要。乳腺癌易感基因1（breast cancer susceptibility gene-1，BRCA1）和乳腺癌易感基因2(breast cancer susceptibility gene-2，BRCA2)在DNA雙鏈損傷的同源重組修復中承擔很重要的角色，對DNA雙鏈斷裂修復的忠實性起著重要作用。BRCA1、BRCA2基因的突變會造成DNA雙鏈斷裂修復功能缺陷，

2、導致體細胞突變的累積，容易誘發(fā)乳腺、卵巢及其他腫瘤的發(fā)生。鑒于BRCA1、BRCA2基因在DNA損傷修復中的重要作用，本課題擬研究BRCA1、BRCA2基因表達狀態(tài)對腫瘤細胞及乳腺癌患者的影響。
　　 第一部分BRCA1/BRCA2基因敲減對鼠Eμ-Myc p19Arf-/-細胞藥物敏感性的影響
　　 目的:通過RNA干擾技術(shù)構(gòu)建BRCA1和BRCA2敲減的Eμ-Myc p19Arf-/-鼠淋巴瘤細胞。用30余種藥物對其

3、進行處理，篩選出基因敲減后對藥物敏感性影響較大的藥物。
　　 方法:構(gòu)建表達BRCA1和BRCA2 shRNA的逆轉(zhuǎn)錄病毒并感染Eμ-Myc p19Arf-/-鼠淋巴瘤細胞。用30余種藥物作用于BRCA1/BRCA2基因穩(wěn)定敲減的Eμ-Mycp19Arf-/-細胞系，比較基因敲減對藥物敏感性的影響。
　　 結(jié)果:成功構(gòu)建了BRCA1、BRCA2穩(wěn)定敲減的Eμ-Myc p19Arf-/-細胞系。用DDP，CPT，SAHA，

4、AZD2281，Ara-C，clofarabine，5-FU等藥物作用于BRCA1基因敲減的細胞，其死亡率要高于對照組BRCA1正常表達的細胞;用DDP, CPT,17-AAG,AZD2281，TFT等藥物作用于BRCA2基因敲減的細胞，其死亡率要高于對照組BRCA2正常表達的細胞。
　　 結(jié)論:BRCA1基因敲減后細胞對DDP、CPT、SAHA、AZD2281、Ara-C、clofarabine、5-FU等藥物有較明顯的增敏作

5、用;BRCA2基因敲減后細胞對DDP、CPT、17-AAG、AZD2281、TFT等藥物有較明顯的增敏作用。為BRCA相關(guān)的腫瘤患者的治療選擇提供了新思路。
　　 第二部分阿糖胞苷對BRCA1/BRCA2基因敲減的鼠Eμ-Mycp19Arf-/-細胞DNA損傷及周期、凋亡的影響
　　 目的:通過western blot檢測阿糖胞苷作用后細胞內(nèi)γ H2AX表達水平變化，流式細胞儀檢測阿糖胞苷處理后的BRCA1/BRCA2基

6、因敲減的鼠Eμ-Myc p19Arf-/-細胞周期及凋亡的影響。
　　 方法:構(gòu)建表達BRCA1和BRCA2shRNA的逆轉(zhuǎn)錄病毒并感染Eμ-Myc p19Arf-/-鼠淋巴瘤細胞。用合適濃度的阿糖胞苷作用于該細胞，利用western blot檢測阿糖胞苷作用后細胞內(nèi)γ H2AX表達水平變化，并用流式細胞儀檢測該細胞周期及凋亡的變化。
　　 結(jié)果:阿糖胞苷處理后，細胞內(nèi)γ H2AX表達明顯增高，并且BRCA1基因敲減的E

7、μ-Myc p19Arf-/-細胞中γ H2AX增高較BRCA1正常表達的細胞明顯，而BRCA2敲減的細胞中γH2AX的表達與正常細胞無明顯差異;阿糖胞苷處理以后，BRCA1及BRCA2正常表達及基因敲減后的Eμ-Myc p19Arf-/-細胞在G1期的細胞均明顯增多，提示藥物作用后細胞周期被阻滯在G1期。BRCA1及BRCA2正常表達及敲減的Eμ-Myc p19Arf-/-細胞早期及晚期凋亡率均明顯升高，并且BRCA1基因敲減的細胞凋

8、亡率要高于BRCA1正常表達的細胞。而BRCA2基因敲減的細胞雖然凋亡率較未用阿糖胞苷處理的細胞升高，但與BRCA2正常表達的細胞相比無明顯區(qū)別。
　　 結(jié)論:阿糖胞苷處理以后會導致細胞內(nèi)累積DSB，并使BRCA1及BRCA2敲減的Eμ-Myc p19Arf-/-細胞被阻滯在G1期，后引起細胞凋亡。
　　 第三部分BRCA1、BRCA2在乳腺癌組織中的表達及其臨床意義
　　 目的:通過對乳腺癌和癌旁組織中BRCA

9、1及BRCA2蛋白的表達情況及其與乳腺癌臨床病理參數(shù)相關(guān)性的探討，分析其作為乳腺癌預后或預測因子的可行性，為臨床治療的選擇提供一定的理論基礎。
　　 方法:收集434例乳腺癌和135例癌旁組織的手術(shù)標本，制作乳腺癌組織芯片，利用免疫組化技術(shù)研究BRCA1、BRCA2蛋白在乳腺癌及癌旁組織中的表達情況及其臨床意義。
　　 結(jié)果:BRCA1和BRCA2蛋白在乳腺癌旁組織中的表達明顯高于癌組織。BRCA1陽性表達水平在淋巴結(jié)無

10、轉(zhuǎn)移組明顯高于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組;在PR陽性組明顯高于PR陰性組;在非三陰型乳腺癌組明顯高于三陰型乳腺癌組，其差異具有統(tǒng)計學意義。BRCA2陽性表達水平在PR陰性組明顯高于PR陽性組，在三陰型乳腺癌組明顯高于非三陰型乳腺癌組，其差異具有統(tǒng)計學意義。多因素分析顯示PR與BRCA1顯著相關(guān)。生存分析結(jié)果提示患者生存期長短與BRCA1和BRCA2表達水平無顯著相關(guān)性。COX比例風險回歸模型進行預后獨立因素分析，發(fā)現(xiàn)分期、PR表達水平是獨立預后因素。