BRCA1-2基因與Eμ-Myc p19Arf---細(xì)胞藥物敏感性及其表達(dá)在乳腺癌中的臨床意義.pdf

1、DNA損傷修復(fù)是細(xì)胞對(duì)外界損傷的主要防御體系，對(duì)維持基因組的完整性至關(guān)重要。乳腺癌易感基因1（breast cancer susceptibility gene-1，BRCA1）和乳腺癌易感基因2(breast cancer susceptibility gene-2，BRCA2)在DNA雙鏈損傷的同源重組修復(fù)中承擔(dān)很重要的角色，對(duì)DNA雙鏈斷裂修復(fù)的忠實(shí)性起著重要作用。BRCA1、BRCA2基因的突變會(huì)造成DNA雙鏈斷裂修復(fù)功能缺陷，

2、導(dǎo)致體細(xì)胞突變的累積，容易誘發(fā)乳腺、卵巢及其他腫瘤的發(fā)生。鑒于BRCA1、BRCA2基因在DNA損傷修復(fù)中的重要作用，本課題擬研究BRCA1、BRCA2基因表達(dá)狀態(tài)對(duì)腫瘤細(xì)胞及乳腺癌患者的影響。
　　 第一部分BRCA1/BRCA2基因敲減對(duì)鼠Eμ-Myc p19Arf-/-細(xì)胞藥物敏感性的影響
　　 目的:通過(guò)RNA干擾技術(shù)構(gòu)建BRCA1和BRCA2敲減的Eμ-Myc p19Arf-/-鼠淋巴瘤細(xì)胞。用30余種藥物對(duì)其

3、進(jìn)行處理，篩選出基因敲減后對(duì)藥物敏感性影響較大的藥物。
　　 方法:構(gòu)建表達(dá)BRCA1和BRCA2 shRNA的逆轉(zhuǎn)錄病毒并感染Eμ-Myc p19Arf-/-鼠淋巴瘤細(xì)胞。用30余種藥物作用于BRCA1/BRCA2基因穩(wěn)定敲減的Eμ-Mycp19Arf-/-細(xì)胞系，比較基因敲減對(duì)藥物敏感性的影響。
　　 結(jié)果:成功構(gòu)建了BRCA1、BRCA2穩(wěn)定敲減的Eμ-Myc p19Arf-/-細(xì)胞系。用DDP，CPT，SAHA，

4、AZD2281，Ara-C，clofarabine，5-FU等藥物作用于BRCA1基因敲減的細(xì)胞，其死亡率要高于對(duì)照組BRCA1正常表達(dá)的細(xì)胞;用DDP, CPT,17-AAG,AZD2281，TFT等藥物作用于BRCA2基因敲減的細(xì)胞，其死亡率要高于對(duì)照組BRCA2正常表達(dá)的細(xì)胞。
　　 結(jié)論:BRCA1基因敲減后細(xì)胞對(duì)DDP、CPT、SAHA、AZD2281、Ara-C、clofarabine、5-FU等藥物有較明顯的增敏作

5、用;BRCA2基因敲減后細(xì)胞對(duì)DDP、CPT、17-AAG、AZD2281、TFT等藥物有較明顯的增敏作用。為BRCA相關(guān)的腫瘤患者的治療選擇提供了新思路。
　　 第二部分阿糖胞苷對(duì)BRCA1/BRCA2基因敲減的鼠Eμ-Mycp19Arf-/-細(xì)胞DNA損傷及周期、凋亡的影響
　　 目的:通過(guò)western blot檢測(cè)阿糖胞苷作用后細(xì)胞內(nèi)γ H2AX表達(dá)水平變化，流式細(xì)胞儀檢測(cè)阿糖胞苷處理后的BRCA1/BRCA2基

6、因敲減的鼠Eμ-Myc p19Arf-/-細(xì)胞周期及凋亡的影響。
　　 方法:構(gòu)建表達(dá)BRCA1和BRCA2shRNA的逆轉(zhuǎn)錄病毒并感染Eμ-Myc p19Arf-/-鼠淋巴瘤細(xì)胞。用合適濃度的阿糖胞苷作用于該細(xì)胞，利用western blot檢測(cè)阿糖胞苷作用后細(xì)胞內(nèi)γ H2AX表達(dá)水平變化，并用流式細(xì)胞儀檢測(cè)該細(xì)胞周期及凋亡的變化。
　　 結(jié)果:阿糖胞苷處理后，細(xì)胞內(nèi)γ H2AX表達(dá)明顯增高，并且BRCA1基因敲減的E

7、μ-Myc p19Arf-/-細(xì)胞中γ H2AX增高較BRCA1正常表達(dá)的細(xì)胞明顯，而BRCA2敲減的細(xì)胞中γH2AX的表達(dá)與正常細(xì)胞無(wú)明顯差異;阿糖胞苷處理以后，BRCA1及BRCA2正常表達(dá)及基因敲減后的Eμ-Myc p19Arf-/-細(xì)胞在G1期的細(xì)胞均明顯增多，提示藥物作用后細(xì)胞周期被阻滯在G1期。BRCA1及BRCA2正常表達(dá)及敲減的Eμ-Myc p19Arf-/-細(xì)胞早期及晚期凋亡率均明顯升高，并且BRCA1基因敲減的細(xì)胞凋

8、亡率要高于BRCA1正常表達(dá)的細(xì)胞。而BRCA2基因敲減的細(xì)胞雖然凋亡率較未用阿糖胞苷處理的細(xì)胞升高，但與BRCA2正常表達(dá)的細(xì)胞相比無(wú)明顯區(qū)別。
　　 結(jié)論:阿糖胞苷處理以后會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)累積DSB，并使BRCA1及BRCA2敲減的Eμ-Myc p19Arf-/-細(xì)胞被阻滯在G1期，后引起細(xì)胞凋亡。
　　 第三部分BRCA1、BRCA2在乳腺癌組織中的表達(dá)及其臨床意義
　　 目的:通過(guò)對(duì)乳腺癌和癌旁組織中BRCA

9、1及BRCA2蛋白的表達(dá)情況及其與乳腺癌臨床病理參數(shù)相關(guān)性的探討，分析其作為乳腺癌預(yù)后或預(yù)測(cè)因子的可行性，為臨床治療的選擇提供一定的理論基礎(chǔ)。
　　 方法:收集434例乳腺癌和135例癌旁組織的手術(shù)標(biāo)本，制作乳腺癌組織芯片，利用免疫組化技術(shù)研究BRCA1、BRCA2蛋白在乳腺癌及癌旁組織中的表達(dá)情況及其臨床意義。
　　 結(jié)果:BRCA1和BRCA2蛋白在乳腺癌旁組織中的表達(dá)明顯高于癌組織。BRCA1陽(yáng)性表達(dá)水平在淋巴結(jié)無(wú)

10、轉(zhuǎn)移組明顯高于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組;在PR陽(yáng)性組明顯高于PR陰性組;在非三陰型乳腺癌組明顯高于三陰型乳腺癌組，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。BRCA2陽(yáng)性表達(dá)水平在PR陰性組明顯高于PR陽(yáng)性組，在三陰型乳腺癌組明顯高于非三陰型乳腺癌組，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。多因素分析顯示PR與BRCA1顯著相關(guān)。生存分析結(jié)果提示患者生存期長(zhǎng)短與BRCA1和BRCA2表達(dá)水平無(wú)顯著相關(guān)性。COX比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型進(jìn)行預(yù)后獨(dú)立因素分析，發(fā)現(xiàn)分期、PR表達(dá)水平是獨(dú)立預(yù)后因素。