RAD51C基因與Eμ-Myc p19Arf---細(xì)胞藥物敏感性及其表達(dá)在乳腺癌中的臨床意義.pdf

1、研究背景：
　　 同源重組(homologous recombination，HR)是細(xì)胞中的一項(xiàng)基礎(chǔ)生命活動(dòng)，在維持細(xì)胞基因組完整性，修復(fù)內(nèi)源或外源性原因造成的DNA雙鏈損傷(double-strandbreak，DSB)中起重要作用。細(xì)胞在發(fā)生DSB時(shí)，主要依靠?jī)煞N方式進(jìn)行修復(fù)，一種是同源重組修復(fù)(homologous recombination repair, HRR)，另一種是非同源末端連接(non-homologous

2、 end joining，NHEJ)。HR作為一種無(wú)差錯(cuò)的修復(fù)方式，是絕大多數(shù)細(xì)胞生命活動(dòng)所必須的。
　　 RAD51C是DNA損傷修復(fù)(DNA damage response，DDR)過(guò)程中的一個(gè)重要角色，將DNA損傷信號(hào)傳遞到下游并保證了HR參與損傷的修復(fù)。在DNA損傷發(fā)生后數(shù)分鐘內(nèi)，RAD51C在RAD51聚集之前即定位到損傷處，提示RAD51C在參與了HR早期的反應(yīng)。同時(shí)，DNA損傷時(shí)ATM磷酸化激活下游CHK2蛋白的過(guò)

3、程，需要RAD51C的參與，從而阻滯細(xì)胞周期，引起DNA修復(fù)或凋亡等反應(yīng)。該研究還發(fā)現(xiàn)，DNA損傷后，RAD51C聚集形成的焦點(diǎn)到RAD51焦點(diǎn)消失后仍然持續(xù)存在，提示RAD51C可能在HR的后期也發(fā)揮作用。另外許多研究也證實(shí)了RAD51C在HR后期中的重要作用。比如RAD51C參與了HR中Holliday交叉(Holliday Junction，HJ)的分支遷移和拆分。研究也發(fā)現(xiàn)，在鼠胚胎成纖維細(xì)胞(mouse embryonic f

4、ibroblasts，MEFs)中敲除RAD51C基因后HJ拆分活動(dòng)顯著減少。
　　 由于HR通路在DNA損傷修復(fù)中起到關(guān)鍵性作用，可以預(yù)見，HR相關(guān)基因的突變將會(huì)導(dǎo)致無(wú)法修復(fù)的DNA損傷的積累，并因此引起細(xì)胞癌變，最終導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn)，RAD51C基因突變?cè)黾恿巳橄侔┖吐殉舶┑陌l(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。此外，RAD51C基因突變還與范科尼貧血(Fanconi anemia，F(xiàn)A)樣疾病的發(fā)病相關(guān)。
　　 鑒于RAD51C基因在D

5、NA損傷修復(fù)中的重要作用，本課題研究了RAD51C基因表達(dá)狀態(tài)對(duì)腫瘤細(xì)胞及乳腺癌患者的影響。實(shí)驗(yàn)共分為三個(gè)部分:第一部分，利用RAD51C基因敲減的Eμ-Myc p19Arf-/-鼠淋巴瘤細(xì)胞，用三十余種常用抗腫瘤藥物作用于該細(xì)胞，篩選出RAD51C基因敲減后對(duì)其藥物敏感性影響較大的藥物;第二部分，利用PARP-1抑制劑奧拉帕尼作用于RAD51C基因敲減的Eμ-Myc p19Arf-/-鼠淋巴瘤細(xì)胞，觀察奧拉帕尼對(duì)該細(xì)胞周期及凋亡的影響

6、;第三部分，利用我科前期建立的組織芯片庫(kù)，通過(guò)免疫組化的方法研究人乳腺癌和癌旁組織中RAD51C蛋白表達(dá)情況，并對(duì)其表達(dá)與乳腺癌臨床病理學(xué)特征的相關(guān)性進(jìn)行了探討。
　　 第一部分RAD51C基因表達(dá)抑制對(duì)抗腫瘤藥物在鼠Eμ-Mycp19Arf-/-細(xì)胞中作用的影響
　　 目的:通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體靶向抑制Eμ-Myc p19Arf-/-鼠淋巴瘤細(xì)胞中RAD51C基因的表達(dá)，在30余種藥物中篩選出RAD51C基因敲減后對(duì)其藥

7、物敏感性影響較大的藥物。
　　 方法:利用RAD51C-shRNA逆轉(zhuǎn)錄病毒載體感染Eμ-Myc p19Arf-/-細(xì)胞株，構(gòu)建RAD51C基因穩(wěn)定敲減的Eμ-Myc p19Arf-/-細(xì)胞系。用30余種藥物作用于該細(xì)胞系，采用以流式細(xì)胞儀為基礎(chǔ)的GFP競(jìng)爭(zhēng)測(cè)定方法在Eμ-Myc p19Arf-/-細(xì)胞系中對(duì)RAD51C基因敲減前后30余種藥物的作用進(jìn)行比較。
　　 結(jié)果:用RAD51C-shRNA逆轉(zhuǎn)錄病毒載體感染Eμ

8、-Myc p19Arf-/-細(xì)胞可以有效降低該細(xì)胞內(nèi)RAD51C基因的表達(dá)。RAD51C基因沉默的細(xì)胞在CPT, DDP,17-AAG和olaparib等藥物作用后死亡率高于RAD51C正常表達(dá)的細(xì)胞。
　　 結(jié)論:RAD51C基因敲減后，會(huì)增加Eμ-Myc p19Arf-/-細(xì)胞對(duì)CPT, DDP,17-AAG和olaparib等藥物的敏感性。
　　 第二部分奧拉帕尼對(duì)RAD51C基因敲減的鼠Eμ-Myc p19Arf

9、-/-細(xì)胞DNA損傷及周期、凋亡的影響
　　 目的:通過(guò)western blot檢測(cè)奧拉帕尼作用后細(xì)胞內(nèi)γ-H2AX表達(dá)水平變化，流式細(xì)胞儀檢測(cè)奧拉帕尼對(duì)RAD51C基因敲減的鼠Eμ-Myc p19Arf-/-細(xì)胞周期及凋亡的影響。
　　 方法:利用RAD51C-shRNA逆轉(zhuǎn)錄病毒載體感染Eμ-Myc p19Arf-/-細(xì)胞株，構(gòu)建RAD51C基因穩(wěn)定敲減的Eμ-Myc p19Arf-/-細(xì)胞系。用一定濃度的奧拉帕尼作

10、用于該細(xì)胞，一定時(shí)間后利用western blot檢測(cè)奧拉帕尼作用后細(xì)胞內(nèi)γ-H2AX表達(dá)水平變化，并用流式細(xì)胞儀檢測(cè)該細(xì)胞周期分布及凋亡的變化。
　　 結(jié)果:奧拉帕尼作用后，細(xì)胞內(nèi)γ-H2AX表達(dá)明顯增高，并且RAD51C基因敲減的Eμ-Myc p19Arf-/-細(xì)胞中γ-H2AX增高較RAD51C正常表達(dá)的細(xì)胞明顯;RAD51C正常表達(dá)及基因敲減的Eμ-Myc p19Arf-/-細(xì)胞處于早期S期的比例增多，提示細(xì)胞被阻滯在S

11、期;并且兩種細(xì)胞在奧拉帕尼作用后早期和晚期凋亡率均明顯增加，RAD51C敲減的Eμ-Myc p19Arf-/-細(xì)胞早期凋亡率及晚期凋亡率均高于RAD51C正常表達(dá)的細(xì)胞。
　　 結(jié)論:奧拉帕尼作用后會(huì)使Eμ-Myc p19Arf-/-細(xì)胞內(nèi)累積DSB，并使RAD51C敲減的Eμ-Myc p19Arf-/-細(xì)胞周期阻滯在S期，繼而引起細(xì)胞凋亡。
　　 第三部分乳腺癌組織中RAD51C蛋白的表達(dá)及其臨床意義
　　 目

12、的:通過(guò)免疫組化的方法研究人乳腺癌和癌旁組織中RAD51C蛋白表達(dá)情況，并對(duì)其表達(dá)與乳腺癌臨床病理學(xué)特征的相關(guān)性進(jìn)行探討。
　　 方法:收集213例乳腺癌和99例癌旁組織的手術(shù)標(biāo)本，制作乳腺癌組織芯片，利用免疫組化技術(shù)研究RAD51C在乳腺癌及癌旁組織中的表達(dá)情況及其臨床意義。
　　 結(jié)果:乳腺癌及癌旁組織中RAD51C表達(dá)無(wú)顯著差異。RAD51C蛋白陽(yáng)性表達(dá)率在HER2表達(dá)陽(yáng)性的患者中明顯高于HER-2表達(dá)陰性患者，其