PD-L1在乳腺癌中的表達(dá)及其臨床意義.pdf

1、研究背景：
　　乳腺癌是乳腺上皮細(xì)胞發(fā)生癌變的惡性腫瘤，是世界上嚴(yán)重威脅女性健康的惡性腫瘤之一?，F(xiàn)在全球乳腺癌的發(fā)病率逐年上升，近年來中國大部分的城市調(diào)查顯示乳腺癌的發(fā)病率和死亡率居前二位，有逐年上升的趨勢(shì)，成為人口疾病中死亡率增長(zhǎng)最快的癌癥，而且乳腺癌的發(fā)病年齡出現(xiàn)年輕化的趨勢(shì)，隨著年齡增大發(fā)病率也增加。因此防治乳腺癌具有重要的意義。乳腺癌按其浸潤(rùn)程度可分為原位癌、浸潤(rùn)性癌，以浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌多見。目前乳腺癌發(fā)病的機(jī)制尚未完全清楚，

2、但是腫瘤的發(fā)生、發(fā)展是一個(gè)極其復(fù)雜的過程，是癌基因和抑癌基因參與的多因素、多階段及多步驟的過程。乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展過程與多種腫瘤相關(guān)因子及其功能改變密切相關(guān)。腫瘤的發(fā)生是在某些復(fù)雜因素作用下，細(xì)胞在基因水平表達(dá)出現(xiàn)異常，復(fù)制、轉(zhuǎn)錄及翻譯，無論哪個(gè)環(huán)節(jié)均可出現(xiàn)調(diào)控失常，最終使細(xì)胞產(chǎn)生異常增殖。當(dāng)機(jī)體免疫功能絮亂，免疫因子發(fā)生異常的情況下也可導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生發(fā)展。
　　T淋巴細(xì)胞是機(jī)體免疫應(yīng)答的重要細(xì)胞，是識(shí)別外源性抗原及發(fā)生有效免疫應(yīng)

3、答的關(guān)鍵、是抗腫瘤免疫的基礎(chǔ)。在免疫系統(tǒng)中，T細(xì)胞、抗原提呈細(xì)胞(APC)以及T細(xì)胞受體(TCR)與多種協(xié)同刺激分子受體的關(guān)系是極其復(fù)雜的，協(xié)同刺激分子既可激活T細(xì)胞，也可傳遞負(fù)性調(diào)節(jié)信號(hào)抑制T細(xì)胞的活化。T細(xì)胞的活化以及抑制信號(hào)的相互作用在調(diào)節(jié)機(jī)體免疫系統(tǒng)識(shí)別內(nèi)源性及外源性抗原發(fā)揮特別重要作用，從而防止自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展。T淋巴細(xì)胞發(fā)揮作用主要表現(xiàn)為T細(xì)胞的活化與增殖，免疫應(yīng)答初期，TCR識(shí)別并結(jié)合由APC上抗原肽-MHC分子復(fù)

4、合物，接著由抗原提呈細(xì)胞上的協(xié)同刺激分子提供刺激信號(hào)，這樣T細(xì)胞才能產(chǎn)生免疫應(yīng)答反應(yīng)。免疫應(yīng)答過程中的雙重信號(hào)是必須同時(shí)存在才能完成的，如果免疫應(yīng)答過程中出現(xiàn)協(xié)同刺激分子減少，僅有第一信號(hào)將會(huì)導(dǎo)致T細(xì)胞活化受抑制或者是特異性免疫耐受，T細(xì)胞進(jìn)入失去功能的無應(yīng)答狀態(tài)，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡并失去抵抗腫瘤的免疫能力。根據(jù)協(xié)同刺激分子的功能各異可將其分為正性協(xié)同刺激分子和負(fù)性協(xié)同刺激分子。
　　近年來發(fā)現(xiàn)B7家族的新成員程序性死亡配體-1(P

5、D-L1)是典型的負(fù)性協(xié)同刺激分子，是目前免疫學(xué)研究領(lǐng)域的熱門對(duì)象之一。PD-1稱程序性死亡-1，是CD28/CTLA-4家族成員之一，其配體是B7家族成員PD-L1和PD-L2。 PD-1通常與其配體共同組成信號(hào)通路，并能傳導(dǎo)抑制性信號(hào)給T細(xì)胞從而阻斷正常免疫應(yīng)答的發(fā)生。PD-1是由288個(gè)氨基酸組成的免疫球蛋白超家族Ⅰ型跨膜糖蛋白，由胞外區(qū)、疏水性跨膜區(qū)、胞漿區(qū)共同組成。其胞外區(qū)由一個(gè)IgV樣結(jié)構(gòu)域、4個(gè)重要的N連接糖基化位點(diǎn)構(gòu)成，

6、該結(jié)構(gòu)可能在與配體的結(jié)合中發(fā)揮重要的作用。胞漿區(qū)含兩個(gè)酪氨酸殘基，形成免疫受體酪氨酸抑制基序(ITIM)和免疫受體酪氨酸轉(zhuǎn)換基序(ITSM)，而免疫受體酪氨酸抑制基序可通過酪氨酸的磷酸化作用拮抗抗原受體刺激信號(hào)的功能，因此在免疫應(yīng)答過程中發(fā)揮重要的負(fù)性調(diào)控作用。PD-1表達(dá)于自然殺傷細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和活化的單核細(xì)胞、活化的T細(xì)胞、B細(xì)胞上。正常狀態(tài)下T、B細(xì)胞不表達(dá)PD-1，但是在激活情況下其表達(dá)上調(diào)。
　　PD-1的兩個(gè)配體PD

7、-L1和PD-L2均屬B7家族成員。PD-1/PD-L1介導(dǎo)的負(fù)性刺激信號(hào)途徑能夠抑制T細(xì)胞的功能，在免疫調(diào)節(jié)反應(yīng)中起負(fù)性調(diào)節(jié)作用，并且對(duì)自身免疫、腫瘤免疫、移植免疫及慢性病毒感染等都有重要的意義。大量研究表明PD-L1在T細(xì)胞免疫反應(yīng)中的調(diào)解作用具有雙重性。首先，PD-L1能刺激初始的T細(xì)胞增殖、分化;另外，其可抑制活化的T細(xì)胞增殖、分化，甚至促進(jìn)T細(xì)胞的凋亡，導(dǎo)致效應(yīng)性T細(xì)胞生物功能受到顯著抑制。生理狀態(tài)下，組織細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、免疫

8、細(xì)胞等表面表達(dá)PD-L1，它與活化T細(xì)胞表面PD-1結(jié)合，抑制T細(xì)胞進(jìn)一步增殖、活化，使機(jī)體的免疫應(yīng)答反應(yīng)維持在一定水平，處于動(dòng)態(tài)平衡。而PD-L1對(duì)T細(xì)胞不同的作用還會(huì)受到TCR和CD28信號(hào)的強(qiáng)弱的影響，在低于適量TCR信號(hào)刺激時(shí)，PD-L1對(duì)T細(xì)胞的增殖明顯抑制;在沒有CD28協(xié)同刺激信號(hào)時(shí)給予最適量TCR信號(hào)，此時(shí)是促進(jìn)T細(xì)胞增殖的作用。有研究表明，PD-L1能與受體PD-1結(jié)合后能顯著降低IL-2、IFN-γ和IL-10的分泌

9、。而CD4+T細(xì)胞可自分泌IL-2，而大量的IL-2能與PD-1/PD-L1途徑產(chǎn)生的抑制作用相拮抗。對(duì)于CD8+T細(xì)胞自分泌的IL-2較少但分泌大量IFN-γ，因此，PD-1/PD-L1途徑對(duì)CD8+T細(xì)胞的抑制作用更加明顯?？傊?，PD-1/PD-L1抑制途徑對(duì)活化的CD8+T細(xì)胞的進(jìn)一步增殖和活化有顯著的抑制作用，腫瘤細(xì)胞能借助此途徑逃逸CTL的殺傷作用，從而減弱機(jī)體對(duì)腫瘤細(xì)胞的免疫應(yīng)答。PD-1/PD-L1途徑產(chǎn)生的抑制效應(yīng)可以被

10、CD28信號(hào)或IL-2所逆轉(zhuǎn)。應(yīng)用阻斷型抗PD-L1單抗阻斷PD-1/PD-L1信號(hào)能夠通過上調(diào)IL-2、IFN-γ的分泌而有效逆轉(zhuǎn)CD4+T和CD8+T細(xì)胞的增殖受抑，同時(shí)明顯增強(qiáng)T細(xì)胞的活化程度和殺傷能力。Dong等在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)帶有PD-L1基因的P815腫瘤細(xì)胞系在體外試驗(yàn)中可抵抗CTL裂解，腫瘤細(xì)胞表達(dá)的PD-L1與活化的腫瘤抗原特異性CD8+T細(xì)胞上的PD-1結(jié)合，能促進(jìn)該T細(xì)胞的凋亡，小鼠接種后其致瘤性和侵襲性更加強(qiáng)

11、。而通過阻斷PD-1/PD-L1信號(hào)相互作用則可逆轉(zhuǎn)該信號(hào)通路的抑制效應(yīng)，增強(qiáng)CTL的殺傷腫瘤細(xì)胞的功能，有效抑制腫瘤的生長(zhǎng)。有研究證實(shí)在負(fù)荷黑色素瘤細(xì)胞的小鼠上接種阻斷性抗PD-L1單抗能阻斷PD-1/PD-L1途徑在腫瘤免疫應(yīng)答中的作用，能有效延長(zhǎng)小鼠的生存時(shí)間。
　　目前乳腺癌的治療手段從原來單一的手術(shù)治療發(fā)展為現(xiàn)在的包括手術(shù)治療、化學(xué)治療、放射治療及生物學(xué)治療的綜合性治療。隨著分子生物學(xué)、免疫學(xué)研究的出現(xiàn)，不斷深入探索使分

12、子免疫學(xué)領(lǐng)域的知識(shí)得以在乳腺癌治療中應(yīng)用，越來越多的免疫學(xué)分子指標(biāo)成為了乳腺癌研究的熱點(diǎn)。如近年來，ER、PR、HER-2已成為乳腺癌患者免疫組織化學(xué)常規(guī)檢查的標(biāo)志性項(xiàng)目。盡管乳腺癌被認(rèn)為是免疫原性不如黑色素瘤或腎細(xì)胞癌，但越來越多的證據(jù)表明乳腺癌與機(jī)體免疫應(yīng)答反應(yīng)相關(guān)。有研究揭示了在外周血以及乳腺癌患者的腫瘤中存在免疫調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)。此外，有研究發(fā)現(xiàn)乳腺癌組織內(nèi)，PD-L1和CD28分子家族的抑制性受體在腫瘤免疫特異性T細(xì)胞

13、上的表達(dá)上調(diào)。綜上所述，PD-L1參與了腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程，并協(xié)助腫瘤細(xì)胞逃避機(jī)體免疫系統(tǒng)的殺傷作用，使腫瘤可以進(jìn)一步惡化。對(duì)于乳腺癌與PD-L1表達(dá)上調(diào)是否有關(guān)系，需要進(jìn)一步的研究來明確。
　　目的：
　　探討PD-L1在乳腺癌中的表達(dá)情況，以及其與患者臨床病理參數(shù)、預(yù)后的相關(guān)性。為乳腺癌的治療以及預(yù)后提供臨床參考價(jià)值。
　　方法：
　　1.提取乳腺癌細(xì)胞株mRNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后，并以此為模板進(jìn)行熒光定

14、量PCR，檢測(cè)乳腺癌細(xì)胞中PD-L1基因的表達(dá);
　　2.用Western Blot（蛋白質(zhì)印跡）法檢測(cè)10對(duì)乳腺癌及癌旁組織的PD-L1蛋白的表達(dá)量;
　　3.購乳腺癌組織芯片，用免疫組化的方法檢測(cè)乳腺癌組織中PD-L1的表達(dá)，分析其與患者各項(xiàng)臨床指標(biāo)及預(yù)后的關(guān)系;
　　4.資料數(shù)據(jù)采用SPSS13.0版統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。檢測(cè)乳腺癌細(xì)胞株P(guān)D-L1表達(dá)采用單向方差分析、多重比較采用LSD法檢驗(yàn);蛋白印跡檢測(cè)PD-

15、L1蛋白，兩組間的比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn);PD-L1陽性表達(dá)與乳腺癌臨床病理特點(diǎn)之間的關(guān)系采用x2檢驗(yàn)、Fisher確切概率法。生存分析采用Kaplan-Meier方法進(jìn)行分析，生存率比較用Log-rank檢驗(yàn)。多元回歸分析采用COX回歸模型進(jìn)行分析。P＜0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　結(jié)果：
　　1.qRT-PCR結(jié)果顯示，乳腺癌細(xì)胞株中ZR-75-1（2.7±0.46）、BT-20（3.8±0.35）、MDA-MB-2

16、31（5.23±0.35）以及BT-549（4.0±0.56）具有較高的PD-L1表達(dá)，而在MCF-7、SKBr-3、T47D及BT-474細(xì)胞株中表達(dá)較低。
　　2.為了驗(yàn)證PD-L1蛋白在乳腺癌組織中的表達(dá)，我們收集了10對(duì)乳腺癌及癌旁的組織。通過Western Blot檢驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)10對(duì)組織中，乳腺癌中的PD-L1均較癌旁組織表達(dá)高。應(yīng)用ImageJ軟件分析計(jì)算蛋白條帶灰度值，經(jīng)兩樣本配對(duì)T檢驗(yàn)顯示乳腺癌組織中PD-L1蛋

17、白表達(dá)明顯高于癌旁組織(P＜0.05)。
　　3.PD-L1在乳腺癌組織中表達(dá)陽性率為22.7％，PD-L1表達(dá)與乳腺癌患者T分期、N分期、ER受體、PR受體相關(guān)(P＜0.05)?；颊咧蠵D-L1陽性的其T、N分期高，且以ER、PR受體陰性為主。PD-L1陽性的患者生存時(shí)間明顯縮短(P=0.000)。多因素COX回歸分析結(jié)果顯示PD-L1是影響乳腺癌患者生存及預(yù)后的獨(dú)立因素(P=0.038)。
　　結(jié)論：
　　1.乳腺