TXNIP在乳腺癌中的表達(dá)和臨床意義.pdf

1、腫瘤的形成過程是一個多階段的、復(fù)雜的過程并且涉及原癌基因的激活和抑癌基因的失活。正常時原癌基因是不致癌的，當(dāng)人體受到細(xì)菌、病毒、理化因素和精神因素刺激時，原癌基因被激活，發(fā)生異常，致使人體細(xì)胞增生不受控制、出現(xiàn)異常增生、發(fā)生惡性變，形成腫瘤。人體還存在著一種抑癌基因，它可以控制人體細(xì)胞正常分裂、增值，抑制細(xì)胞的異常增生和癌變。當(dāng)抑癌基因受到病毒感染、電離輻射等損傷后，腫瘤抑制基因功能喪失，細(xì)胞正常分裂與增生的平衡被打破，使細(xì)胞分裂與增殖

2、不受控制，細(xì)胞出現(xiàn)異常增生或異倍體增殖，細(xì)胞突變、形成腫瘤。近年來多個研究表明TXNIP基因在腫瘤的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移過程中擔(dān)任著重要的角色，TXNIP基因是一個新的抑癌基因，它在人類肝癌、肺癌等癌組織中均表達(dá)下降，并且與腫瘤的轉(zhuǎn)移相關(guān)，TXNIP的缺失可以促使腫瘤細(xì)胞的增殖和抑制細(xì)胞凋亡的進(jìn)程。伴隨著人類基因組計劃的完成，各種基因的篩選已成為目前基因研究的熱點(diǎn)，而探索腫瘤進(jìn)展和轉(zhuǎn)移的相關(guān)基因?qū)ε卸[瘤的預(yù)后、指導(dǎo)治療措施的選擇及研發(fā)新的治療措

3、施和方案都具有重要的指導(dǎo)意義。
　　 背景和目的：乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，在我國占全身各種惡性腫瘤的7％-10％，呈逐年上升趨勢，部分大城市報告乳腺癌占女性惡性腫瘤之首位。20歲前本病少見，20歲以后發(fā)病率迅速上升，45-50歲較高，絕經(jīng)后發(fā)病率繼續(xù)上升，可能與年老者雌酮含量提高相關(guān)。月經(jīng)過早來潮（小于12歲）或絕經(jīng)晚（遲于55歲），未生育，晚育（第一胎在35歲以后）或生育后不哺乳，乳癌的發(fā)生率較高。近年來，隨著診斷和

4、治療水平的不斷進(jìn)步，對乳腺癌患者術(shù)后的5年生存率，乳腺癌術(shù)后生存質(zhì)量都有很大的提高，但是晚期乳腺癌的治療效果仍然有待提高。因此，關(guān)于乳腺癌發(fā)病因素的探討，以期早期發(fā)現(xiàn)、早期治療并提高臨床療效已成為臨床研究的重點(diǎn)之一。
　　 硫氧還蛋白結(jié)合蛋白（thioredoxin-interacting protein，TXNIP），又名維生素D3上調(diào)蛋白1（vitamin D3 up-regulating protein1，VDUP1），是

5、a-視紫紅質(zhì)抑制蛋白家族成員之一，而且是家族中唯一可以與硫氧還蛋白(thioredoxin，Trx)結(jié)合的蛋白。TXNIP能通過與Trx活性半胱氨酸殘基的結(jié)合而抑制其抗氧化功能，同時參與調(diào)節(jié)體內(nèi)活性氧系統(tǒng)以及線粒體通路的過程，誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡程序，表現(xiàn)了TXNIP在細(xì)胞發(fā)育過程中的介導(dǎo)作用。編碼TXNIP的基因位于人染色體1q21-22，包含8個外顯子，長4174bp。TXNIP基因首次在用1，25二羥基維生素D-3處理的人類白血病細(xì)胞系

6、HL-60中被發(fā)現(xiàn)，研究表明,TXNIP基因相關(guān)的細(xì)胞增殖周期失控和NK細(xì)胞發(fā)育異常等與腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移聯(lián)系密切。
　　 目前關(guān)于TXNIP在乳腺癌中表達(dá)情況的報道甚少，與臨床病理特征的關(guān)系尚無公認(rèn)的結(jié)論。為此，我們采用實時定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)方法檢測16例乳腺癌和配對癌旁組織中的TXNIP mRNA的表達(dá)水平，用免疫印跡(western blot)法檢測7例乳腺癌及配對癌旁組織中的TXNIP蛋白表達(dá)水平;用免

7、疫組織化學(xué)鏈霉素抗生物素蛋白一過氧化物酶連結(jié)法（SP法）對50例乳腺癌及配對癌旁組織中的TXNP蛋白進(jìn)行半定量檢測。應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計軟件，分別探討TXNIPmRNA在乳腺癌及配對癌旁組織中的表達(dá)水平，和TXNIP蛋白在乳腺癌和癌旁組織重的表達(dá)水平及其與乳腺癌患者年齡、臨床分期、病理組織學(xué)分化等的關(guān)系。
　　 方法與內(nèi)容：
　　 1.研究對象本研究共收集南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院2011-2012年間存檔的50例乳腺癌及

8、配對的癌旁組織，所有患者術(shù)前均未經(jīng)化療或放療，病理診斷浸潤性導(dǎo)管癌。其中年齡≤50歲29例，年齡＞50歲21例，平均年齡44.68歲;TNM分期Ⅰ～Ⅱ期20例，Ⅲ～Ⅳ期30例;中高分化乳腺癌26例，低分化乳腺癌24例。組織標(biāo)本蠟塊常規(guī)切片。
　　 2.研究方法
　　 A.qRT-PCR法檢測TXNIP mRNA的表達(dá) a.樣品總RNA的制備:PBS清洗組織樣品，剪碎，液氮中研磨。然后采用TRIZOL法提取組織細(xì)胞中的總R

9、NA，用紫外分光光度計及瓊脂糖凝膠電泳檢提取到的RNA的完整性、純度和含量。 b.cDNA合成反轉(zhuǎn)錄前直接將6.5ul的RNA加入到反轉(zhuǎn)錄體系中合成cDNA。反應(yīng)體系為10ul，其中PrimeScript RT Enzyme Mix10.5ul、5×PrimeScriptBuffer2ul、Oligo dT Primer（引物）0.5ul。于PCR儀進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)條件為:37℃15min，85℃5s。c.qRT-PCR采用SYBR G

10、reen熒光染料法進(jìn)行實時定量PCR擴(kuò)增的檢測。PCR反應(yīng)體系為20ul，其中2×SYBRpremixEXTaq TM10ul，上下游引物各0.4ul(10umol/L)、cDNA2ul，dH2O7.2ul。于實時定量PCR儀分別進(jìn)行TXNIP和β-actin的PCR反應(yīng)，擴(kuò)增條件為:95℃預(yù)變性30s;95℃變性10s，58℃退火15s，72℃延伸10s，45個循環(huán)后，72℃延伸10min。反應(yīng)過程中同時設(shè)陽性對照，以水替代cDNA為

11、陰性對照。TXNIP mRNA相對表達(dá)量采用2-△CT進(jìn)行計算，△CT=CTTXNIP-CTβ-actin。
　　 （所用的TXNIP引物序列:上游5'-GACTTCGGAGTACCTGCGCTATG-3'，下游5'-AAGCTCAAAGCCGAACTTGTACTCA-3'，所用的β-actin引物序列:上游5'-TGG CAC CCA GCA CAA TGA A-3'，下游5'-CTA AGT CAT AGT CCGCCT A

12、GA AGC A-3')。
　　 B.western blot檢測TXNIP蛋白表達(dá)a.提取總蛋白乳腺癌組織和對應(yīng)癌旁組織，剪碎，PBS洗滌3遍，液氮中研磨，最后加入200ul的蛋白裂解液冰浴裂解，抽提組織細(xì)胞總蛋白。b.按50ug/孔上樣，在10％的SDS-PAGE凝膠中進(jìn)行電泳分離，濕轉(zhuǎn)法將蛋白質(zhì)從SDS-PAGE凝轉(zhuǎn)移至PVDF膜，在含5％脫脂奶粉的TTBS中室溫封閉90min，加入一抗（兔抗人TXNIP抗體，稀釋度為1:

13、200），4℃孵育過夜，TTBS充分漂洗(10min×3次)，加入二抗（羊抗兔IgG，即用型），37℃作用40min，TTBS充分漂洗（10min×3次），化學(xué)熒光法(ECL)顯色，壓片，顯影，定影，觀察結(jié)果。
　　 C.免疫組織化學(xué)法a.采用免疫組化SP法，乳腺癌及配對的癌旁乳腺組織切片常規(guī)脫蠟水化，置入0.01mol/L的檸檬酸緩沖液中，用微波修復(fù)法進(jìn)行抗原修復(fù)，冷卻至室溫，3％的H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，孵育15min

14、，PBS沖洗3次，每次3min，滴加山羊血清封閉液，室溫下孵育25min，滴加50ul兔抗人TXNIP單克隆抗體(1∶100)，4℃孵育過夜，PBS沖洗5次，每次5min，滴加50ul二抗，室溫孵育45min，PBS沖洗5次，每次5min，DAB顯色1～3min，蘇木素復(fù)染，常規(guī)脫水透明，中性樹膠封片。同時設(shè)置陰、陽性對照。b.半定量結(jié)果判斷免疫組化染色，無棕黃色為0分;淡棕黃色為1分;棕黃色為2分;棕褐色為3分。同樣物鏡下觀察陽性細(xì)胞

15、數(shù)，無陽性細(xì)胞數(shù)為0分;陽性細(xì)胞數(shù)≤10％為1分;陽性細(xì)胞數(shù)11％～50％為2分;陽性細(xì)胞數(shù)＞50％為3分。將染色深度和陽性細(xì)胞數(shù)百分比的得分相乘，2分及以上為陽性。c.統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS13.0軟件進(jìn)行處理。數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，計量資料采用t檢驗，計數(shù)資料采用x2檢驗，P＜0.05有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)果：
　　 1.qRT-PCR檢測TXNIP mRNA水平組織標(biāo)本提前的RNA完整性好。經(jīng)過檢測16例乳腺

16、癌組織與對應(yīng)癌旁組織中TXNIP的mRNA表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)TXNIP的mRNA的平均水平在乳腺癌組織(39.07±12.34)與對應(yīng)癌旁組織中(40.12±13.13)無明顯差異(P＞0.05）。
　　 2.western blot檢測TXNIP蛋白表達(dá)水平同時我們隨機(jī)選取了7例乳腺癌與對應(yīng)癌旁乳腺組織樣品，免疫印跡分析它們之間TXNIP的表達(dá)水平差異，發(fā)現(xiàn)在5例樣品中，TXNIP蛋白在乳腺癌組織中的相對表達(dá)量低于正常癌旁組織中的

17、相對表達(dá)量(圖1.A-E)，而在另2例樣品中，TXNIP的蛋白質(zhì)相對表達(dá)量沒有明顯變化(圖1.F-G)，TXNIP蛋白在乳腺癌組織中的表達(dá)灰度值為0.43±0.11，明顯較對應(yīng)的癌旁組織的0.85±0.01低(P＜0.05)（圖1）
　　 3.免疫組化檢測TXNIP在乳腺癌組織中的表達(dá)水平
　　 A.TXNIP在乳腺癌和乳腺癌癌旁組織中的表達(dá)兩者均有表達(dá)，其陽性染色呈棕黃色彌漫染色或顆粒狀主要分布于細(xì)胞質(zhì)，部分細(xì)胞核也有

18、表達(dá)。在乳腺癌癌旁組織中的陽性表達(dá)率為72.00％，乳腺癌中的陽性表達(dá)率為52.00％，差異有顯著性，P＜0.05(圖2-4)。
　　 B.TXNIP和乳腺癌臨床病理特征的關(guān)系Ⅰ～Ⅱ期乳腺癌TXNIP蛋白的陽性表達(dá)率為80.00％，Ⅲ～Ⅳ期乳腺癌TXNIP蛋白的陽性表達(dá)率為33.33％，Ⅰ～Ⅱ期和Ⅲ～Ⅳ期乳腺癌的TXNIP蛋白表達(dá)水平具有顯著差異異(P＜0.05），Ⅰ～Ⅱ期乳腺癌配對的癌旁組織TXNIP蛋白陽性表達(dá)率為85％，Ⅰ

19、～Ⅱ期乳腺癌及其配對的癌旁組織TXNIP蛋白表達(dá)水平無顯著差異，Ⅲ～Ⅳ期乳腺癌配對的癌旁組織TXNIP蛋白陽性表達(dá)率為63.33％，Ⅲ～Ⅳ期乳腺癌及其配對的癌旁組織TXNIP蛋白表達(dá)水平具有顯著差異(P＜0.05）;中高分化乳腺癌TXNIP蛋白的陽性表達(dá)率為73.07％，低分化乳腺癌TXNIP蛋白的陽性表達(dá)率為29.16％，中高分化和低分化乳腺癌的TXNIP蛋白表達(dá)水平具有顯著差異(P＜0.05），中高分化乳腺癌配對的癌旁組織TXNIP

20、蛋白陽性表達(dá)率為73.07％，中高分化乳腺癌及其配對的癌旁組織TXNIP蛋白表達(dá)水平無顯著差異，低分化乳腺癌配對的癌旁組織TXNIP陽性表達(dá)率為70.83％，低分化乳腺癌及其配對的癌旁組織TXNIP蛋白表達(dá)水平具有顯著差異(P＜0.05）。
　　 結(jié)論：
　　 1、TXNIP的表達(dá)水平和TXNIP蛋白表達(dá)水平不在乳腺癌組織與對應(yīng)癌旁組織中，TXNIP mRNA一致。
　　 2、TXNIP蛋白表達(dá)水平和乳腺癌的臨床