幽門螺桿菌CagA介導(dǎo)Cdx2調(diào)控p21表達(dá)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo).pdf

1、胃癌是我國常見的惡性腫瘤之一，近年來患病率逐年上升且日益年輕化。幽門螺桿菌(Helicobacterpylori，Hp)是慢性活動(dòng)性胃炎和消化性潰瘍的重要病因，并與胃腺癌和胃黏膜相關(guān)淋巴組織淋巴瘤的發(fā)病密切，但其致瘤分子機(jī)制尚不清楚。 細(xì)胞毒素相關(guān)基因A(cytotoxinassociated-geneA,CagA)是Hp的重要毒力因子，通過細(xì)胞毒素相關(guān)因子致病性島Ⅳ型分泌系統(tǒng)(typeⅣsecretionsystem,TFSS

2、)導(dǎo)入細(xì)胞后被內(nèi)源性Src絡(luò)氨酸蛋白激酶(Srchomology2(SH2)-containingtyrosinephosphatase，SHP-2)磷酸化，然后與SHP-2磷酸酶的結(jié)合并誘發(fā)其活化。磷酸化的CagA觸發(fā)一系列的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路變化；而使用SHP-2特異性磷酸酶抑制劑calpeptin可完全抑制SHP-2，阻斷這一信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路引發(fā)的生物學(xué)行為改變。 p21/WAF1/CIP1(p21)是目前已知的具有最廣泛激酶

3、抑制活性的細(xì)胞周期素依賴性激酶抑制子(Cyclin-dependentkinaseinhibitor,CDKI)，在細(xì)胞周期中起負(fù)性調(diào)節(jié)作用，抑制細(xì)胞增殖，使細(xì)胞周期不能進(jìn)入S期而停滯在G1期。p21與各種細(xì)胞周期素Cyclin以及細(xì)胞周期素依賴性激酶CDK(Cyclin-dependentkinase)組成了細(xì)胞周期抑制因子與激活因子網(wǎng)絡(luò)，共同調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的轉(zhuǎn)換及動(dòng)態(tài)平衡。由于p21的異常轉(zhuǎn)錄或表達(dá)與多種惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，它被

4、認(rèn)為是一個(gè)重要的抑癌基因。在胃癌發(fā)生發(fā)展的多階段過程中，隨著胃黏膜病變惡性程度的增高而p21表達(dá)降低。 本研究擬從Hp毒性因子CagA入手，以CagA野生型及其同基因突變體CagA突變型Hp菌株為實(shí)驗(yàn)對(duì)照誘導(dǎo)體系，研究幽門螺桿菌CagA介導(dǎo)Cdx2調(diào)控p21表達(dá)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，并結(jié)合Cdx2及p21在胃癌癌變多階段病變過程中的表達(dá)情況，探討Cdx2及p21在腸型胃癌發(fā)病中的可能機(jī)制。 本研究分兩部分： 第一部分幽門螺

5、桿菌CagA介導(dǎo)Cdx2調(diào)控p21表達(dá)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo) 第1節(jié)幽門螺桿菌CagA誘導(dǎo)AGS胃癌細(xì)胞Cdx2表達(dá)失調(diào) 目的：觀察幽門螺桿菌CagA誘導(dǎo)的AGS胃癌細(xì)胞Cdx2核移位改變以及對(duì)Cdx2表達(dá)水平的影響。 方法：采用CagA野生型和CagA突變型Hp菌株，以不加幽門螺桿菌菌株為空白對(duì)照，分別誘導(dǎo)人胃癌細(xì)胞株AGS(幽門螺桿菌與細(xì)胞比例為100：1)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要在不同時(shí)間點(diǎn)收獲細(xì)胞。采用間接免疫熒光法聯(lián)合激光共

6、聚焦熒光顯微鏡技術(shù)(LCFM)觀察幽門螺桿菌CagA誘導(dǎo)Cdx2核移位改變，Westernblot、RT-PCR和RealTimePCR分別用于觀察Cdx2蛋白及mRNA的表達(dá)。 結(jié)果：LCFM顯示，加入CagA野生型幽門螺桿菌誘導(dǎo)前，AGS細(xì)胞Cdx2蛋白主要表達(dá)在胞漿，加入CagA野生型幽門螺桿菌誘導(dǎo)后，Cdx2蛋白在細(xì)胞核的分布逐漸增多，并呈時(shí)間依賴性增強(qiáng)，提示在CagA野生型幽門螺桿菌誘導(dǎo)下，Cdx2蛋白由胞漿移位到胞核

7、；而在CagA突變型幽門螺桿菌中，Cdx2蛋白的核移位不如CagA野生型幽門螺桿菌誘導(dǎo)明顯；而在未加幽門螺桿菌菌株的空白對(duì)照組沒有觀察到Cdx2由細(xì)胞漿向細(xì)胞核的移位。用calpeptin處理后，CagA野生型Hp誘導(dǎo)下AGS細(xì)胞的Cdx2核移位較處理前減弱。 RT-PCR和RealTimePCR結(jié)果均顯示，cagA野生型Hp誘導(dǎo)下AGS細(xì)胞的Cdx2mRNA表達(dá)呈時(shí)間依賴性增加；在誘導(dǎo)后12小時(shí)時(shí)間點(diǎn)對(duì)比AGS細(xì)胞分別在cag

8、A野生型及cagA突變型Hp作用下的Cdx2mRNA表達(dá)，發(fā)現(xiàn)cagA野生型Hp誘導(dǎo)的Cdx2mRNA表達(dá)水平明顯高于cagA突變型Hp；calpeptin處理后，cagA野生型Hp誘導(dǎo)細(xì)胞Cdx2mRNA水平明顯下降，而在cagA突變型Hp誘導(dǎo)細(xì)胞中Cdx2下調(diào)不明顯。 Westernblot結(jié)果顯示，cagA野生型Hp誘導(dǎo)下AGS細(xì)胞的Cdx2蛋白表達(dá)呈時(shí)間依賴性增加，12小時(shí)達(dá)到高峰并維持在較高水平，因此，我們?cè)?2小時(shí)時(shí)

9、間點(diǎn)進(jìn)行阻斷實(shí)驗(yàn)；在誘導(dǎo)后12小時(shí)時(shí)間點(diǎn)對(duì)比AGS細(xì)胞分別在cagA野生型及cagA突變型Hp作用下的Cdx2蛋白表達(dá)，發(fā)現(xiàn)cagA野生型Hp誘導(dǎo)的Cdx2蛋白表達(dá)水平明顯高于cagA突變型Hp；calpeptin處理后，cagA野生型Hp誘導(dǎo)細(xì)胞Cdx2蛋白水平明顯下降，而在cagA突變型Hp誘導(dǎo)細(xì)胞中Cdx2蛋白下調(diào)不明顯。 結(jié)論：幽門螺桿菌CagA可誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子Cdx2核移位改變，并導(dǎo)致Cdx2在mRNA及蛋白質(zhì)表達(dá)水平上

10、調(diào)。 第2節(jié)幽門螺桿菌CagA誘導(dǎo)AGS胃癌細(xì)胞Cdx2失調(diào)引發(fā)p21異常表達(dá) 目的：研究Cdx2在p21啟動(dòng)子區(qū)是否具有結(jié)合活性，并探討幽門螺桿菌CagA在AGS胃癌細(xì)胞誘導(dǎo)的Cdx2失調(diào)能否引發(fā)p21的異常表達(dá)。 方法：用非同位素凝膠移動(dòng)遷移率檢測(cè)方法(SUPER-EMSA)檢測(cè)檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子Cdx2與DNA結(jié)合狀態(tài)；Westernblot、RT-PCR和RealTimePCR方法觀察cagA野生型/突變型Hp

11、誘導(dǎo)下以及calpeptin阻斷后AGS細(xì)胞的p21mRNA和蛋白表達(dá)變化。 結(jié)果：EMSA顯示，在cagA野生型Hp誘導(dǎo)下AGS細(xì)胞Cdx2與p21探針結(jié)合，呈時(shí)間依賴性增強(qiáng)；cagA突變型Hp誘導(dǎo)下AGS細(xì)胞Cdx2與p21探針結(jié)合能力明顯下降。 RT-PCR和RealTimePCR結(jié)果均顯示，cagA野生型Hp誘導(dǎo)下AGS細(xì)胞的p21mRNA表達(dá)呈時(shí)間依賴性下調(diào)；在誘導(dǎo)后12小時(shí)時(shí)間點(diǎn)對(duì)比AGS細(xì)胞分別在cagA野

12、生型及cagA突變型Hp作用下的p21mRNA表達(dá)，發(fā)現(xiàn)cagA野生型Hp誘導(dǎo)的p21mRNA表達(dá)水平明顯低于cagA突變型Hp；calpeptin處理后，cagA野生型Hp誘導(dǎo)細(xì)胞p21mRNA水平明顯上調(diào)，而在cagA突變型Hp誘導(dǎo)細(xì)胞中p21上調(diào)不明顯。 Westernblot結(jié)果顯示，cagA野生型Hp誘導(dǎo)下AGS細(xì)胞的p21蛋白表達(dá)呈時(shí)間依賴性減少；在誘導(dǎo)后12小時(shí)時(shí)間點(diǎn)對(duì)比AGS細(xì)胞分別在cagA野生型及cagA突變

13、型Hp作用下的p21蛋白表達(dá)，發(fā)現(xiàn)cagA野生型Hp誘導(dǎo)的p21蛋白表達(dá)水平明顯低于cagA突變型Hp；calpeptin處理后，cagA野生型Hp誘導(dǎo)細(xì)胞p21蛋白水平明顯增強(qiáng)，而在cagA突變型Hp誘導(dǎo)細(xì)胞中p21蛋白增強(qiáng)不明顯。 結(jié)論：Cdx2與p21啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合位點(diǎn)(TTTAT)結(jié)合，幽門螺桿菌CagA誘導(dǎo)Cdx2表達(dá)失調(diào)導(dǎo)致p21的異常表達(dá)。 第3節(jié)幽門螺桿菌CagA誘導(dǎo)下p21異常表達(dá)導(dǎo)致胃癌細(xì)胞周期的異常改

14、變 目的：研究幽門螺桿菌CagA誘導(dǎo)下細(xì)胞周期各個(gè)時(shí)相細(xì)胞的動(dòng)態(tài)變化以及相關(guān)p21蛋白含量表達(dá)。 方法：利用流式細(xì)胞術(shù)分析幽門螺桿菌CagA誘導(dǎo)下細(xì)胞周期各個(gè)時(shí)相的動(dòng)態(tài)變化，并采用DNA含量和平均熒光強(qiáng)度雙參數(shù)方法檢測(cè)p21蛋白實(shí)時(shí)表達(dá)。 結(jié)果：cagA野生型Hp誘導(dǎo)下，隨著時(shí)間推移，AGS細(xì)胞G1期細(xì)胞下降，S期細(xì)胞明顯增加，G2期的細(xì)胞無明顯變化；在12小時(shí)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行阻斷實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示：與cagA野生型Hp相

15、比，cagA突變型Hp誘導(dǎo)AGS細(xì)胞G1期細(xì)胞增加；同時(shí)S期細(xì)胞下降，G2期的細(xì)胞無明顯變化，上述效應(yīng)與cagA密切相關(guān)。 cagA野生型Hp誘導(dǎo)AGS細(xì)胞后，與對(duì)照組相比，AGS細(xì)胞p21相對(duì)熒光強(qiáng)度逐漸下降；在12小時(shí)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行阻斷實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示：與cagA野生型Hp相比，cagA突變型Hp誘導(dǎo)AGS細(xì)胞12小時(shí)后，AGS細(xì)胞p21相對(duì)熒光強(qiáng)度相對(duì)增強(qiáng)，p21的相對(duì)熒光強(qiáng)度改變與cagA密切相關(guān)。 結(jié)論：幽門螺桿菌C

16、agA可誘導(dǎo)p21異常表達(dá)，引發(fā)細(xì)胞周期失調(diào)。 第二部分Cdx2和p21在胃癌癌變多階段組織中蛋白表達(dá)和意義 目的：在前期研究基礎(chǔ)上，檢測(cè)Cdx2及p21在人體胃癌癌變多階段組織中的表達(dá)，進(jìn)一步在體內(nèi)水平驗(yàn)證其在腸型胃癌演變過程中的作用。 方法：采用免疫組織化學(xué)ABC法檢測(cè)104例慢性淺表性胃炎、98例慢性萎縮性胃炎、112例胃黏膜腸上皮化生、106例胃黏膜不典型增生和93腸型胃癌組織中Cdx2及p21蛋白的表達(dá)

17、。 結(jié)果：Cdx2在慢性淺表性胃炎和慢性萎縮性胃炎組織中無表達(dá)，在胃黏膜腸上皮化生組織中的蛋白表達(dá)陽性率顯著高于胃黏膜不典型增生和腸型胃癌(P＜0.05)，陽性表達(dá)率分別為86.6％(97/112)、58.5％(62/106)和56.9％(53/93)。 p21在胃癌癌變多階段組織中均有表達(dá)，表達(dá)陽性率分別為92.3％(96/104)、89.8％(88/98)、58.0％(65/112)、52.8％(56/106)、46