Akt-Mdm2-p53信號通路在幽門螺桿菌致病中的作用.pdf

1、背景和目的:
　　 幽門螺桿菌(Helicobacter pylori,Hp)感染約占全球人口的一半,但只有少部分的感染者發(fā)病?，F(xiàn)已明確,Hp是慢性胃炎、消化性潰瘍、胃MALT淋巴瘤和胃癌的致病因子。在正常胃黏膜中,胃上皮細胞增殖和凋亡保持動態(tài)平衡,而Hp感染能打破這一平衡,并與感染結(jié)局及致病多樣性密切相關(guān)。目前有關(guān)Hp導致胃上皮細胞凋亡增殖的研究中,結(jié)論很不一致,甚至相互矛盾。許多體內(nèi)研究表明Hp感染既可促進胃上皮細胞凋亡,又

2、可誘導細胞增殖,從而加速了細胞的更新,認為和其誘導的免疫炎癥反應和代償性增生有關(guān)。許多體外研究報道Hp能直接誘導胃上皮細胞凋亡,但也有研究認為Hp主要是刺激胃上皮細胞增殖,并能在早期直接激活細胞增殖信號通路,促進DNA合成增加,從而使細胞惡變風險增加。目前體外研究所選用的大多是不同類型的胃癌上皮細胞,而這些胃癌細胞本身在凋亡、增殖信號傳導等方面已存在異常。不同濃度的Hp和作用時間長短的影響也不同,這可能是結(jié)果不一致的原因之一。
　

3、　 在細胞凋亡增殖的調(diào)控中,Akt-Mdm2-p53通路發(fā)揮重要作用。Akt促進細胞增殖和抗細胞凋亡,它磷酸化Mdm2,使Mdm2穩(wěn)定和可更有效地轉(zhuǎn)位到核內(nèi),通過泛素化途徑降解p53蛋白而下調(diào)p53功能,使細胞能抗衡p53介導的凋亡。而Mdm2也是p53的一個靶基因,可被p53負反饋調(diào)控。同時,p53可通過上調(diào)PTEN,而發(fā)揮間接抑制Akt的作用。因此,Akt-Mdm2-p53信號通路在決定細胞凋亡或增殖中扮演重要角色,而它在Hp致病

4、中的作用尚不清楚。
　　 因此,針對以上研究現(xiàn)狀,本課題研究不同階段胃黏膜病變中Akt-Mdm2-p53信號通路相關(guān)蛋白的表達和Hp感染的關(guān)系;同時進行體外實驗研究,選用來源于人正常胃上皮細胞的GES-1細胞為實驗對象(預試驗提示能表達野生型p53),研究Hp培養(yǎng)濾液對GES-1細胞凋亡增殖的直接影響及和Akt-Mdm2-p53信號通路的關(guān)系,為探討Hp的致病機制提供理論和實驗依據(jù)。
　　 方法：
　　 1、收集

5、Hp陽性和陰性的慢性非萎縮性胃炎(CNAG)、化生性萎縮(MA)、異型增生(Dys)和胃癌(GC)胃黏膜病理標本,行.Akt-Mdm2-p53信號通路相關(guān)蛋白的檢測。
　　 2、制備NCTC11637Hp標準菌株培養(yǎng)濾液,測定濃度為11.1mg/ml,以此為初濃度,稀釋不同的濃度,和GES-1細胞共培養(yǎng),設立只加Hp培養(yǎng)液的對照組,根據(jù)實驗在不同時間點收集細胞行相應檢測。
　　 3、Akt信號通路的阻斷:加40umol/

6、L的LY294002預處理GES-1細胞1h,設立加40umol/L的DMSO為對照組。
　　 4、相應指標的檢測:
　　 (1)病理標本Hp感染檢測:采用Giemsa染色法檢測。
　　 (2)病理標本蛋白的檢測:應用免疫組化PV-9000法檢測。
　　 (3)細胞形態(tài)學檢測:倒置顯微鏡和電鏡觀察。
　　 (4)細胞活力的檢測:采用四唑藍(MTT)比色試驗檢測。
　　 (5)細胞周期的檢測

7、:采用PI染色流式細胞術(shù)方法檢測。
　　 (6)細胞凋亡的檢測:采用DNA電泳和Annexinv/PI雙染色流式細胞術(shù)檢測。
　　 (7)DNA損傷檢測:采用單細胞凝膠電泳檢測。
　　 (8)細胞mRNA的檢測:采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)法檢測。
　　 (9)細胞蛋白的檢測:采用Western blotting方法檢測。
　　 結(jié)果：
　　 1、不同胃粘膜病變中Hp感染和Akt

8、-Mdm2-p53信號通路表達的關(guān)系
　　 (1)在CNAG、MA、DYS和GC各粘膜病變中分別行Hp陽性者和Hp陰性者比較,pAkt在CNAG組的Hp陽性者顯著高于Hp陰性者(P＜0.05);Akt在各粘膜病變中均無顯著性差異(P＞0.05);Mdm2在Dys組Hp陽性者顯著高于陰性者(P＜0.05);突變型p53在MA組Hp陽性者顯著高于陰性者(P＜0.05);PCNA在Dys組Hp陽性者顯著高于陰性者(P＜0.05);Ba

9、x在CNAG、MA組陽性者顯著高于陰性者(P＜0.05),其余各組無顯著性差異(P＞0.05)。
　　 (2)在Hp陽性的CNAG、MA、DYS和GC各粘膜病變中,Akt、pAkt在各病變組的表達無顯著差異(P＞0.05)。Mdm2、PCNA蛋白的表達在GC、Dys組顯著高于CNAG、MA組(P＜0.05),Bax蛋白的表達在MA組最高,顯著高于CNAG、Dys、GC組(P＜0.05)
　　 (3)在Hp陽性的CNAG、

10、MA、Dys胃粘膜病變中,對pAkt、Mdm2、突變型p53、Bax和PCNA蛋白的表達行相關(guān)性分析,pAkt和Mdm2,Mdm2和PCNA的表達呈正相關(guān)(P＜0.05)。
　　 2、Hp培養(yǎng)濾液對GES-1細胞生物學行為的影響
　　 (1)形念學變化:Hp培養(yǎng)濾液作用GES-1細胞后48h內(nèi)電鏡和倒置顯微鏡下觀察,細胞呈現(xiàn)典型的空泡化、凋亡改變,且隨Hp培養(yǎng)濾液濃度的增加和作用時間的延長而加重。
　　 (2)1

11、:4濃度Hp培養(yǎng)濾液作用GES-1細胞48h后行DNA電泳,結(jié)果DNA條帶呈凋亡特征性梯狀改變,而對照組無此改變。
　　 (3)MTT檢測Hp培養(yǎng)濾液作用GES-1細胞后的增殖活性:在3h、6h和12h時間點,各濃度組的細胞存活率和照組比較均無顯著性差異(P＞0.05)。作用24h,各濃度組的細胞存活率顯著低于對照組(P＜0.05),但各濃度組間無顯著性差異(P＞0.05)。作用48h,1:4、1:2濃度組的細胞存活率(74.7

12、+12.1％,62.2+12.6％)均顯著低于對照組(100.0+8.3％)(P＜0.05),且呈濃度依賴性。但對照組與1:8組之間無顯著性差異(P＞0.05);作用72h時,1:8、1:4、1:2、1:1組的細胞存活率顯著低于對照組(P＜0.05),且呈濃度依賴性,均有顯著性差異(P＜0.05)。行1:8濃度的Hp培養(yǎng)濾液作用GES-1細胞80天后,和平行傳代的對照組比較,細胞存活率顯著增加。(P＜0.05)
　　 (4)流式

13、細胞儀分析顯示:1:4濃度的Hp培養(yǎng)濾液作用GES-1細胞48h后,細胞周期主要阻滯在G0-G1期(98.73±1.12％vs45.37±4.89％),凋亡率顯著上升(26.93±5.34％vs1.65±0.44％)(P＜0.05)。
　　 (5)單細胞凝膠電泳檢測DNA損傷:1:4濃度的Hp培養(yǎng)濾液作用GES-1細胞3h后,和對照組比較,彗星尾部DNA量占全部DNA量的比例無顯著性差異(P＞0.05);作用48h后,彗星尾部D

14、NA量顯著增加。(P＜0.05)。
　　 3、Akt-Mdm2-053信號通路在Hp培養(yǎng)濾液對GES-1細胞影響中的作用
　　 (1)Hp培養(yǎng)濾液作用GES-1細胞后p53、Mdm2、Bax mRNA的表達:1:4濃度的Hp培養(yǎng)濾液作用GES-1細胞48h,p53 mRNA無顯著變化(P＞0.05);Mdm2 mRNA、Bax mRNA的表達顯著上調(diào)(P＜0.05);
　　 (2)Hp培養(yǎng)濾液作用GES-1細胞后

15、Akt-Mdm2-p53通路相關(guān)蛋白水平及活性的變化:1:4濃度的Hp培養(yǎng)濾液作用GES-1細胞不同時間后,Akt蛋白無明顯變化,pAkt在1h后上升,在3h達最高峰,在48h內(nèi)持續(xù)升高,Mdm2蛋白具有類似變化趨勢;p53蛋白12h內(nèi)無明顯變化,在24、48h上升:Bax蛋白在1h后上升,48h內(nèi)持續(xù)升高。
　　 (3)加入Akt抑制劑LY294002處理GES-1細胞后,用1:4濃度的Hp培養(yǎng)濾液作用細胞,與未加入抑制劑比較

16、,12h和24h的細胞存活率顯著下降(P＜0.05)。在作用24h后pAkt、Mdm2蛋白表達顯著下降(P＜0.05),而p53蛋白表達顯著上調(diào)(P＜0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1、Akt-Mdm2-p53信號通路參與了Hp感染相關(guān)的胃黏膜病變發(fā)生、發(fā)展,在Hp感染導致的CNAG、MA、Dys病變階段中起作用,而在胃癌病變階段中與Hp感染無明顯關(guān)系,提示Akt-Mdm2-p53信號通路主要在Hp致癌的早期階段起作用

17、。
　　 2、在短期作用下,Hp培養(yǎng)濾液可導致胃上皮細胞凋亡,活力下降,DNA損傷,且呈濃度和時間依賴關(guān)系;在低濃度培養(yǎng)濾液長期作用下,Hp能誘導胃上皮細胞增殖活性升高。
　　 3、Hp可同時激活凋亡和增殖信號通路。在早期,Hp通過激活Akt和誘導Mdm2的表達對抗Hp誘導的凋亡作用,使p53水平無明顯變化。但在細胞DNA損害加重時,Hp激活p53通路促進細胞凋亡和使細胞阻滯在G0/G1期。在Hp感染時阻斷Akt通路可使