天然衍生脫細(xì)佨牛心包膜復(fù)合BMP-2基因轉(zhuǎn)染的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)引導(dǎo)骨組織再生的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、引導(dǎo)骨組織再生(Guide bone regeneration，GBR)是近年發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)促進(jìn)組織再生愈合的新理論和新技術(shù)。它指利用膜的機(jī)械屏障作用，阻止病損區(qū)周圍生長(zhǎng)較快的其它組織細(xì)胞長(zhǎng)入病損區(qū)，消除其它組織細(xì)胞的競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用，選擇性引導(dǎo)特定細(xì)胞向病損的部位附著、增生，促進(jìn)病損的修復(fù)。近年，種子細(xì)胞和生物活性因子的加入，復(fù)合化和功能化的GBR膜具有更好的引導(dǎo)骨組織再生作用。
　　目前以天然衍生牛心包為基礎(chǔ)制備復(fù)合功能GBR膜

2、的研究較少，本研究分四個(gè)部分，首先以天然牛心包為來(lái)源通過(guò)脫細(xì)胞處理和交聯(lián)處理制備出符合引導(dǎo)骨組織再生技術(shù)要求的天然衍生GBR膜;第二部分進(jìn)行骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)不同方向誘導(dǎo)培養(yǎng)和BMP-2基因轉(zhuǎn)染BMSCs實(shí)驗(yàn)研究，為下一步復(fù)合GBR膜的研究打下基礎(chǔ);第三部分將天然衍生脫細(xì)胞牛心包膜與BMP-2基因轉(zhuǎn)染的BMSCs體外復(fù)合，檢測(cè)其生物相容性和細(xì)胞增殖等情況，為下一步動(dòng)物實(shí)驗(yàn)打下基礎(chǔ);第四部進(jìn)行天然衍生脫細(xì)胞牛心包膜復(fù)合BMP-

3、2基因轉(zhuǎn)染的BMSCs引導(dǎo)骨組織再生的初步動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究，探討脫細(xì)胞牛心包膜復(fù)合BMP-2基因轉(zhuǎn)染的BMSCs臨床上引導(dǎo)骨組織再生、修復(fù)骨缺損的可行性。
　　第一章：天然衍生脫細(xì)胞牛心包膜的制備
　　目的:篩選出一種比較理想的天然衍生牛心包脫細(xì)胞處理和交聯(lián)處理方法，為制備出符合臨床要求的GBR膜材料打下基礎(chǔ)。
　　方法:
　　1.天然牛心包膜采用胰酶去垢劑法(Ⅰ)，胰酶核酸酶法(Ⅱ)，胰酶去垢劑核酸酶聯(lián)合法(Ⅲ)，

4、凍融后去污劑法(Ⅳ)，凍融后核酸酶法(Ⅴ)，凍融后去污劑核酸酶聯(lián)合法(Ⅵ)進(jìn)行脫細(xì)胞處理，通過(guò)光鏡、掃描電鏡觀察，細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)，機(jī)械性能測(cè)定，細(xì)胞趨化性實(shí)驗(yàn)等，篩選出最佳脫細(xì)胞處理方法。
　　2.天然衍生脫細(xì)胞牛心包膜采用戊二醛和京尼平對(duì)其進(jìn)行交聯(lián)處理，通過(guò)光鏡、掃描電鏡觀察，厚度檢測(cè)，機(jī)械性能檢測(cè)，交聯(lián)指數(shù)測(cè)定，體外降解以及細(xì)胞毒性試驗(yàn)等，篩選出最理想脫細(xì)胞牛心包膜交聯(lián)方法。
　　結(jié)果:
　　1.脫細(xì)胞結(jié)果表明:凍融

5、去污劑核酸酶聯(lián)合法處理后牛心包纖維排列致密有序，天然結(jié)構(gòu)保存良好，細(xì)胞毒性低，是最理想的脫細(xì)胞方法。
　　2.交聯(lián)結(jié)果表明:京尼平交聯(lián)脫細(xì)胞牛心包膜比戊二醛交聯(lián)效果具有更好生物相容性，交聯(lián)效果好，是最理想的交聯(lián)方法。
　　結(jié)論:凍融去污劑核酸酶聯(lián)合法是制備脫細(xì)胞牛心包膜最理想的方法;京尼平交聯(lián)的脫細(xì)胞牛心包膜具有更好生物相容性。
　　第二章：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)多向誘導(dǎo)培養(yǎng)及BMP-2基因轉(zhuǎn)染BMSCs實(shí)驗(yàn)研

6、究
　　目的:探索兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)的分離培養(yǎng)方法并對(duì)BMSCs誘導(dǎo)，觀察其多向培養(yǎng)潛能;進(jìn)行BMP-2基因轉(zhuǎn)染BMSCs實(shí)驗(yàn)，為GBR復(fù)合膜研究打下基礎(chǔ)。
　　方法:
　　1.貼壁培養(yǎng)法分離培養(yǎng)兔BMSCs，相差顯微鏡觀察BMSCs的生長(zhǎng)增殖情況;取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的第2代BMSCs，分別用成骨、成脂、成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基對(duì)其進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，然后檢測(cè)BMSCs多向培養(yǎng)生長(zhǎng)情況。
　　2.傳代培養(yǎng)良好的BMS

7、Cs，通過(guò)質(zhì)粒載體，采用電穿孔法轉(zhuǎn)染BMP-2基因，然后進(jìn)行下列鑒定:熒光顯微鏡觀察BMP-2轉(zhuǎn)染BMSCs生長(zhǎng)增殖情況;RT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞的BMP-2 mRNA表達(dá);Westeblot檢測(cè)BMP-2在蛋白水平的表達(dá);ALP檢測(cè)評(píng)價(jià)其成骨分化能力。
　　結(jié)果:
　　1.兔原代及傳代BMSCs細(xì)胞生長(zhǎng)良好;成骨誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)ALP染色結(jié)果陽(yáng)性，茜素紅染色陽(yáng)性;成脂誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)油紅O染色結(jié)果陽(yáng)性;成軟骨誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)Ⅰ型膠原和Aggrec

8、an免疫化學(xué)染色陽(yáng)性。
　　2.BMP-2轉(zhuǎn)染BMSCs的轉(zhuǎn)染效率為41.2±1.1％; RT-PCR結(jié)果表明BMP-2 RNA表達(dá)陽(yáng)性，Westernblot結(jié)果表明轉(zhuǎn)染BMSCs可有效表達(dá)轉(zhuǎn)染基因;BMP-2轉(zhuǎn)染的BMSCs的ALP活性明顯高于空白轉(zhuǎn)染組。
　　結(jié)論:
　　1.原代培養(yǎng)兔BMSCs具有多向生長(zhǎng)能力，可成功誘導(dǎo)培養(yǎng)為脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞。
　　2.BMP-2基因可有效成功轉(zhuǎn)染BMSCs，

9、從而為下步復(fù)合GBR膜研究打下基礎(chǔ)。
　　第三章：脫細(xì)胞牛心包膜復(fù)合BMP-2轉(zhuǎn)染的BMSCs引導(dǎo)骨再生的體外實(shí)驗(yàn)研究
　　目的:探討脫細(xì)胞牛心包復(fù)合BMP-2基因轉(zhuǎn)染的BMSCs材料的生物相容性，細(xì)胞毒性及BMSCs在牛心包膜材料上的貼附、生長(zhǎng)、增殖及成骨分化情況。
　　方法:脫細(xì)胞牛心包膜體外復(fù)合BMP-2轉(zhuǎn)染的BMSCs，通過(guò)掃描電鏡評(píng)估細(xì)胞在脫細(xì)胞牛心包支架材料上的的貼附、生長(zhǎng)與增殖情況，MTT檢測(cè)膜材料對(duì)轉(zhuǎn)染

10、細(xì)胞的細(xì)胞毒性，ELISA檢測(cè)BMP-2含量，結(jié)晶紫染色法測(cè)定BMSCs細(xì)胞粘附能力檢測(cè)， ALP活性實(shí)驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)染BMSCs成骨性能。
　　結(jié)果:
　　1.掃描電鏡結(jié)果表明:脫細(xì)胞牛心包復(fù)合BMP-2基因轉(zhuǎn)染的BMSCs后，細(xì)胞能良好的貼附并增殖。
　　2.細(xì)胞毒性檢測(cè)結(jié)果表明，各組細(xì)胞的存活率沒有明顯差異。
　　3.細(xì)胞粘附能力檢測(cè)結(jié)果表明:脫細(xì)胞牛心包膜增強(qiáng)了BMP-2轉(zhuǎn)染BMSCs細(xì)胞粘附能力。
　　

11、4.ALP活性檢測(cè)、Westernblot檢測(cè)和RT-PCR檢測(cè)結(jié)果表明:脫細(xì)胞牛心包膜增強(qiáng)了BMP-2轉(zhuǎn)染BMSCs向成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化的能力。
　　結(jié)論:脫細(xì)胞牛心包復(fù)合BMP-2基因轉(zhuǎn)染的BMSCs功能膜有良好的生物相容性和細(xì)胞相容性，可能具備更佳的引導(dǎo)骨再生能力。
　　第四章：脫細(xì)胞牛心包膜復(fù)合BMP-2轉(zhuǎn)染的BMSCs引導(dǎo)骨再生的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究
　　目的:將脫細(xì)胞牛心包復(fù)合BMP-2基因轉(zhuǎn)染的BMSCs構(gòu)建的功能膜植

12、入兔下頜骨骨缺損處，探討其引導(dǎo)骨組織再生情況。
　　方法:建立兔下頜骨骨缺損模型，分別植入BMP-2轉(zhuǎn)染的BMSCs/脫細(xì)胞牛心包復(fù)合體（A組）、單純脫細(xì)胞牛心包材料（B組），同時(shí)設(shè)立空白對(duì)照（C組），分別于術(shù)后第4、8、12周行大體肉眼觀察，X線檢測(cè)和組織形態(tài)學(xué)檢測(cè)，觀察其成骨情況。
　　結(jié)果:大體肉眼觀察、X線檢測(cè)、組織形態(tài)學(xué)檢測(cè)結(jié)果表明:術(shù)后第8周及第16周實(shí)驗(yàn)組A，B組骨缺損愈合情況與C組（空白對(duì)照）有顯著差異，且A