自主神經(jīng)系統(tǒng)與角膜的創(chuàng)傷修復(fù).pdf

1、目的:最近研究表明自主神經(jīng)系統(tǒng)主動(dòng)地參與免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)過(guò)程。本研究旨在觀察自主神經(jīng)在角膜上皮損傷修復(fù)過(guò)程中的作用。
　　方法:
　　1.免疫熒光染色
　　使用Anti-酪氨酸羥化酶(TH)分別與Anti-小泡單胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2(VMAT2)和anti-乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶(ChAT)進(jìn)行雙重免疫熒光,觀察交感神經(jīng)和副交感神經(jīng)在小鼠角膜中的分布。Anti-β2-腎上腺素能受體(β2-AR)和anti-α7煙堿型乙酰膽堿能受體(

2、α7nAChR)觀察β2-AR和α7nAChR在角膜組織中的表達(dá)。
　　2.角膜創(chuàng)傷修復(fù)模型建立與觀察
　　在小鼠角膜中央機(jī)械性去除2mm上皮層建立創(chuàng)傷模型。觀察了創(chuàng)傷后再上皮化、細(xì)胞分裂、白細(xì)胞遷移和血小板在角鞏緣血管壁募集的過(guò)程。使用交感神經(jīng)化學(xué)切斷劑6-羥基多巴胺(6-OHDA)、β2-腎上腺素受體(β2-AR)激動(dòng)劑異丙腎上腺素和β2受體拮抗劑噻嗎洛爾檢測(cè)了交感神經(jīng)在創(chuàng)傷修復(fù)中的作用。同時(shí)使用α7nAChR激動(dòng)劑尼古

3、丁和拮抗劑美加明檢測(cè)了副交感神經(jīng)在角膜創(chuàng)傷修復(fù)中的作用。
　　3.定量分析
　　Photoshop CS4分別計(jì)數(shù)Anti-Gr-1-FITC、Anti-CD41-PE和DAPI標(biāo)記的白細(xì)胞、血小板和分裂細(xì)胞數(shù)目;Image-Pro Plus5.1軟件測(cè)量Anti-CD31/PECAM-1標(biāo)記的角膜緣血管直徑。應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,所有計(jì)量結(jié)果均以x±s表示。*p<0.05為顯著性差異,**p<0.0

4、1為非常顯著性差異。
　　結(jié)果:
　　1.交感神經(jīng)與角膜創(chuàng)傷修復(fù)
　　(1)在角膜上皮層、基質(zhì)層和角膜緣都存在TH陽(yáng)性和VMAT2陽(yáng)性神經(jīng)纖維,且兩種陽(yáng)性神經(jīng)纖維均為β-tubulin III陽(yáng)性。上皮層交感神經(jīng)較細(xì)小,基質(zhì)層的卻粗細(xì)相互交錯(cuò)且末梢存在球狀突起,而角膜緣交感神經(jīng)則緊密分布于血管周圍。
　　(2)角膜緣淋巴管內(nèi)皮、血管內(nèi)皮及血管周圍巨噬細(xì)胞表達(dá)許多β2-AR,其中淋巴管內(nèi)皮分布較密集。
　　(

5、3)角膜創(chuàng)傷后,完全上皮化在噻嗎洛爾組需18h,切斷交感神經(jīng)組需24h,對(duì)照組30h,異丙腎上腺素組則超過(guò)60h,而切斷后使用異丙腎上腺素組60h時(shí)可完全上皮化。
　　(4)分裂細(xì)胞數(shù)目與對(duì)照組相比,噻嗎洛爾組在12h呈現(xiàn)高峰,切斷交感神經(jīng)組為18h,而切斷后使用異丙腎上腺素組和單獨(dú)使用異丙腎上腺素組卻一直處于下降趨勢(shì)。
　　(5)正常小鼠角膜基底細(xì)胞從18h開(kāi)始進(jìn)入角膜中央。噻嗎洛爾組基底細(xì)胞提前6h進(jìn)入角膜中央。切斷交感

6、神經(jīng)組和對(duì)照組類似,但是前者基底細(xì)胞密度明顯大于后者。異丙腎上腺素和切斷交感神經(jīng)后使用異丙腎上腺素組基底細(xì)胞密度則遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于對(duì)照組。
　　(6)創(chuàng)傷后角膜緣白細(xì)胞數(shù)量在對(duì)照組呈現(xiàn)高峰期為18h,切斷后使用異丙腎上腺素組、單獨(dú)使用異丙腎上腺素組和噻嗎洛爾組高峰期提前至12h,切斷交感神經(jīng)組白細(xì)胞數(shù)量減少。2、3和4區(qū)白細(xì)胞的變化趨勢(shì)表現(xiàn)為:切斷后使用異丙腎上腺素組、單獨(dú)使用異丙腎上腺素組與正常小鼠類似,而切斷交感神經(jīng)組和噻嗎洛爾組白細(xì)

7、胞數(shù)量均降低。
　　(7)正常小鼠角膜創(chuàng)傷后動(dòng)脈直徑持續(xù)緩慢擴(kuò)張。切斷交感神經(jīng)組動(dòng)脈在創(chuàng)傷后12h之前和對(duì)照組無(wú)差異,而12h之后明顯收縮。噻嗎洛爾組在創(chuàng)傷后至3h急速擴(kuò)張,3h至18h期間緩慢擴(kuò)張并達(dá)到高峰。異丙腎上腺素組創(chuàng)傷后動(dòng)脈擴(kuò)張明顯。切斷后使用異丙腎上腺素組明顯收縮。
　　(8)對(duì)照組靜脈創(chuàng)傷后至3h跳躍式擴(kuò)張,而3h之后緩慢收縮并趨于穩(wěn)定。切斷交感神經(jīng)組靜脈創(chuàng)傷后至6h緩慢擴(kuò)張。噻嗎洛爾組擴(kuò)張趨勢(shì)明顯大于對(duì)照組。

8、異丙腎上腺素組靜脈創(chuàng)傷后6h之后呈緩慢擴(kuò)張趨勢(shì)。切斷后使用異丙腎上腺素組靜脈創(chuàng)傷后持續(xù)緩慢擴(kuò)張。
　　(9)創(chuàng)傷后角膜緣血管周圍血小板的聚集在切斷交感神經(jīng)組和對(duì)照組高峰期為18h,但前者的數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于后者。噻嗎洛爾組血小板數(shù)量高峰期出現(xiàn)在12h,而切斷后使用異丙腎上腺素組和單獨(dú)使用異丙腎上腺素組聚集到角膜緣血管的血小板數(shù)量均很少。
　　2.副交感神經(jīng)與角膜創(chuàng)傷修復(fù)
　　(1)在角膜基質(zhì)層和角膜緣都存在β-tubulin

9、 III陽(yáng)性和ChAT陽(yáng)性神經(jīng)纖維,且大部分ChAT陽(yáng)性神經(jīng)纖維分布在角膜緣血管周圍。
　　(2)角膜緣血管周圍發(fā)現(xiàn)很多α7nAChR和CD301共陽(yáng)性細(xì)胞。
　　(3)尼古丁組在18h提前完成創(chuàng)面的閉合過(guò)程。美加明組在30h仍然沒(méi)有完全再上皮化。
　　(4)尼古丁組分裂細(xì)胞提前在6h和18h達(dá)到波峰期,而美加明組從創(chuàng)傷后分裂細(xì)胞數(shù)量很少。
　　(5)正常小鼠基底細(xì)胞從創(chuàng)傷后18h進(jìn)入角膜中央。與對(duì)照組相比,角膜

10、創(chuàng)傷后尼古丁組從12h開(kāi)始基底細(xì)胞密度便持續(xù)增加。美加明組幾乎無(wú)基底細(xì)胞。
　　(6)尼古丁組四個(gè)區(qū)的白細(xì)胞數(shù)目均降低,其中1區(qū)最明顯。美加明組高峰期與對(duì)照組一致,但數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于對(duì)照組。
　　(7)正常小鼠角膜創(chuàng)傷后動(dòng)脈直徑持續(xù)緩慢擴(kuò)張。尼古丁組在創(chuàng)傷后至12h急速擴(kuò)張,12h至24h期間持續(xù)緩慢擴(kuò)張。美加明組動(dòng)脈明顯擴(kuò)張。
　　(8)尼古丁組靜脈創(chuàng)傷后至6h緩慢擴(kuò)張,之后至12h呈收縮趨勢(shì),而12h之后緩慢擴(kuò)張。而美

11、加明組靜脈創(chuàng)傷后持續(xù)緩慢擴(kuò)張。
　　(9)尼古丁組血小板高峰期和對(duì)照組類似,但是其數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于對(duì)照組。美加明組血小板募集的數(shù)量在創(chuàng)傷后急速持續(xù)增加。
　　結(jié)論:
　　1.在角膜上皮層、基質(zhì)層及角膜緣存在交感神經(jīng)纖維分布。角膜緣血管、淋巴管和巨噬細(xì)胞表達(dá)β2受體。交感神經(jīng)系統(tǒng)興奮抑制角膜上皮創(chuàng)傷后的修復(fù)過(guò)程:再上皮化延遲、有絲分裂數(shù)量下降、嗜中性粒細(xì)胞向創(chuàng)傷區(qū)遷移的加速和血小板在角鞏緣血管壁募集過(guò)程的抑制。而化學(xué)性切除交

12、感神經(jīng)或使用β受體抑制劑則具有加速角膜上皮創(chuàng)傷后修復(fù)過(guò)程的作用:再上皮化加速、有絲分裂數(shù)量波峰提前和嗜中性粒細(xì)胞遷移過(guò)程提前。
　　2.在角膜基質(zhì)層及角膜緣存在副交感神經(jīng)纖維。角膜緣血管周圍巨噬細(xì)胞表達(dá)α7nAChR。局部使用α7nAChR激動(dòng)劑尼古丁可顯著加速角膜上皮創(chuàng)傷后的修復(fù)過(guò)程:再上皮化提前、有絲分裂數(shù)量增加、嗜中性粒細(xì)胞向創(chuàng)傷區(qū)遷移的減慢和血小板在角鞏緣血管壁募集過(guò)程的抑制。與此相反,α7受體抑制劑則顯著抑制角膜上皮創(chuàng)傷