ITP血漿對巨核細(xì)胞生成影響機(jī)制的研究.pdf

1、背景與目的:
　　 特發(fā)性血小板減少性紫癜(idiopathicthrombocytopenicpurpura，ITP)是最常見的自身免疫性出血性疾病，臨床約占出血性疾病的1/3。外周血血小板減少，骨髓巨核細(xì)胞數(shù)量增多或正常并伴有成熟障礙以及體內(nèi)檢測到抗血小板自身抗體是其主要特征。ITP的病因迄今未明。免疫因素和感染目前被認(rèn)為是ITP的主要發(fā)病原因。機(jī)體針對自身血小板膜表面糖蛋白，如GP(Ⅱ)b/(Ⅲ)a、GPIb/(Ⅸ)等，產(chǎn)

2、生自身血小板抗體。致敏后的血小板被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)吞噬，最終導(dǎo)致血小板減少。既然血小板減少是因其破壞增多引起，那么從理論上來講，血小板生成則應(yīng)該代償性增加。但是血小板動力學(xué)實驗卻顯示，有2/3的ITP患者的血小板反而表現(xiàn)為生成減少或正常。因此，血小板破壞增多和血小板生成減少兩個因素共同導(dǎo)致了血小板的減少。作為血小板的前體生成細(xì)胞，巨核細(xì)胞表面也表達(dá)血小板膜糖蛋白。血小板自身抗體作用于巨核細(xì)胞，使其破壞增多或發(fā)育障礙。研究證實，ITP患者的血

3、漿或者純化的血小板膜蛋白抗體能夠抑制體外巨核細(xì)胞生成，導(dǎo)致巨核細(xì)胞數(shù)量降低，集落形成減少。但是臨床上大多數(shù)的ITP患者骨髓內(nèi)巨核細(xì)胞的數(shù)量表現(xiàn)為增多或正常，這種巨核細(xì)胞的增多多被認(rèn)為是代償性的。因此，血小板的減少并不能用巨核細(xì)胞的減少來解釋。另外，形態(tài)學(xué)發(fā)現(xiàn)，這些增多的巨核細(xì)胞同時伴有成熟障礙。
　　 巨核細(xì)胞的發(fā)育是一個由多因素介導(dǎo)的復(fù)雜過程，任何一個環(huán)節(jié)出現(xiàn)異常，都有可能導(dǎo)致巨核細(xì)胞生成障礙。轉(zhuǎn)錄因子在巨核細(xì)胞發(fā)育過程中起關(guān)

4、鍵作用。微小RNA(microRNAs，miRNAs)是一類擁有高度保守序列的非編碼小RNA分子，它可以通過調(diào)控參與巨核細(xì)胞發(fā)育的關(guān)鍵性轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)量來調(diào)控巨核細(xì)胞生成。同一種miRNAs分子可作用于不同的靶基因，多種miRNAs分子也可作用于同一種靶基因。這些miRNAs分子通過各自或聯(lián)合調(diào)控其靶基因表達(dá)量的方式來對巨核細(xì)胞的發(fā)育進(jìn)行調(diào)節(jié)。而巨核細(xì)胞的發(fā)育障礙又是ITP的重要發(fā)病機(jī)制之一。因此，miRNAs或許可通過調(diào)節(jié)巨核細(xì)胞的發(fā)

5、育而參與ITP的發(fā)病。
　　 除去自身抗體因素，病毒感染也被認(rèn)為是ITP發(fā)病的主要原因之一。目前已知的與ITP發(fā)病相關(guān)的病毒主要有:單純皰疹病毒Ⅰ型和Ⅱ型、EB病毒、肝炎病毒、人類免疫缺陷病毒、流感病毒、巨細(xì)胞病毒、風(fēng)疹病毒、水痘帶狀皰疹病毒等。病毒是一種極小的非細(xì)胞形態(tài)寄生生物，只能依賴宿主細(xì)胞進(jìn)行復(fù)制、轉(zhuǎn)錄或翻譯。研究表明，miRNAs除了存在于真核細(xì)胞生物外，也存在于病毒這種非細(xì)胞生物中。雖然目前對病毒miRNAs的研究相

6、對來說還比較粗淺，但是已有諸多研究證實，病毒miRNAs可通過與宿主細(xì)胞相互作用，從而改變自身或宿主某些miRNAs分子或mRNA的表達(dá)，而宿主基因表達(dá)的改變也可以反作用病毒，進(jìn)而促進(jìn)或抑制病毒復(fù)制。目前已有關(guān)于病毒miRNAs參與炎癥、腫瘤發(fā)生的報道，但其與巨核細(xì)胞生成及ITP發(fā)病之間的關(guān)系，卻尚未知曉。因此，探討人miRNAs分子和病毒miRNAs在巨核細(xì)胞中的表達(dá)情況及與ITP的關(guān)系，不僅能為ITP的發(fā)病提供新的線索，而且還能為I

7、TP的臨床診斷和治療提供新的理論依據(jù)和治療手段。
　　 實驗方法:
　　 第一章:臍血單個核細(xì)胞定向擴(kuò)增為巨核細(xì)胞的研究
　　 用肝素抗凝，收集健康新生兒臍帶血。通過密度梯度離心法，分離臍血單個核細(xì)胞。制備體外培養(yǎng)巨核細(xì)胞所需細(xì)胞因子，包括:重組人干細(xì)胞因子(recombinant human stem cell factor，rhSCF)，重組人血小板生成素(recombinant human thrombo

8、poietin，rhTPO)，重組人白介素3(recombinant human inter leukin，rhIL-3)和重組人白介素6(recombinant human inter leukin，rhIL-6)。將分離所得的臍帶血單個核細(xì)胞用含10％胎牛血清的IMDM培養(yǎng)基重懸后，按照5×105個/ml種于24孔板中。加入SCF(50ng/ml)、TPO(20ng/ml)、IL-3(10ng/ml)、IL-6(10ng/ml)及左

9、旋谷氨酰胺(2mM)。每孔終體積為1ml。根據(jù)細(xì)胞因子組合的不同，分為三組:A組SCF+TPO+IL-3，B組SCF+TPO+L-6，和C組SCF+TPO+IL-3+IL-6。培養(yǎng)條件為37℃，5％CO2，每3天半量換液，棄去一半的培養(yǎng)基，并添加全量的細(xì)胞因子，培養(yǎng)10天。三組細(xì)胞除了細(xì)胞因子組合的不同外，其他培養(yǎng)條件完全一致。分別通過倒置顯微鏡和光學(xué)顯微鏡觀察所得巨核細(xì)胞的形態(tài)，并通過流式細(xì)胞儀分析比較三組細(xì)胞CD41a+細(xì)胞的百分比

10、，從而確定體外巨核細(xì)胞擴(kuò)增的最佳體系，為后續(xù)的實驗奠定堅實的基礎(chǔ)。
　　 第二章:ITP患者血漿對巨核細(xì)胞的影響
　　 分別收集24例臨床初診的ITP患者和10例正常人的外周血，通過兩步離心法分離出少血小板的血漿。向體外巨核細(xì)胞培養(yǎng)體系中分別添加ITP患者血漿和正常人血漿，使血漿占培養(yǎng)體系終體積的10％。除去血漿因素外，其他培養(yǎng)條件完全一致。培養(yǎng)10天后，收集兩組細(xì)胞。倒置顯微鏡和光學(xué)顯微鏡觀察兩組細(xì)胞大體形態(tài)的差別;電

11、子顯微鏡分析比較兩組巨核細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的差異;流式細(xì)胞術(shù)比較兩組巨核細(xì)胞的數(shù)量差別;基因芯片分析兩組巨核細(xì)胞miRNAs的表達(dá)差異;實時定量PCR(RealtimequantitativePCR，QRT-PCR)技術(shù)對基因芯片的結(jié)果進(jìn)行驗證性實驗。
　　 第三章:病毒miRNAs與ITP
　　 根據(jù)基因芯片的結(jié)果，篩選出ITP組明顯上調(diào)的6個病毒miRNAs分子，包括ebv-miR-BART6-3p、ebv-miR-BAR

12、T19-3p、hsv1-miR-H7*、hsv1-miR-H8*、hsv1-miR-H14-3p和hsv2-miR-H7-3p。通過QRT-PCR技術(shù)分別對ITP血漿孵育組和正常血漿孵育組的巨核細(xì)胞進(jìn)行驗證性實驗，比較兩組巨核細(xì)胞病毒miRNAs表達(dá)差異是否和基因芯片的結(jié)果一致。
　　 統(tǒng)計學(xué)方法
　　 實驗資料結(jié)果用(x)±S表示，顯著性標(biāo)準(zhǔn)為P＜0.05，采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件包進(jìn)行統(tǒng)計分析。三組不同細(xì)胞因子組

13、合下巨核細(xì)胞百分比的比較采用單因素方差分析(One-WayANOVA)，兩組血漿孵育下巨核細(xì)胞百分比的比較采用非參數(shù)檢驗中的Mann-WhitneyU檢驗，QRT-PCR技術(shù)比較ITP組細(xì)胞中miR-146a較之正常細(xì)胞組的上調(diào)倍數(shù)采用單樣本t檢驗(One-SampleT-Test)。6種病毒miRNAs分子在ITP組的上調(diào)倍數(shù)采用One-SampleT-Test。
　　 結(jié)果:
　　 第一章臍血單個核細(xì)胞定向擴(kuò)增為巨核

14、細(xì)胞的研究
　　 1.倒置顯微鏡下三組巨核細(xì)胞的大體形態(tài)三組巨核細(xì)胞在倒置纖維鏡下的大體形態(tài)無明顯差異。C組大細(xì)胞的比例明顯高于A、B兩組，細(xì)胞密度高，體積大。
　　 2.瑞氏吉姆薩染色后觀察巨核細(xì)胞形經(jīng)瑞氏吉姆薩染色后，光學(xué)顯微鏡下觀察可見:細(xì)胞胞體巨大，胞核不規(guī)則，核染色質(zhì)排列緊密，胞質(zhì)粉紅色，內(nèi)或有大小不等的小顆粒，胞膜不清晰，有偽足伸出。
　　 3.流式細(xì)胞術(shù)分析比較三組巨核細(xì)胞的數(shù)量差異巨核細(xì)胞特異性表

15、面抗原CD41a的檢測:根據(jù)FSC、SSC圈出巨核細(xì)胞群，分析CD41a+細(xì)胞所占比例。三組數(shù)據(jù)方差齊，因此采用單因素方差分析(One-wayANOVA)對數(shù)掘進(jìn)行檢驗，其中C組巨核細(xì)胞百分比為(36.03±0.27)％，顯著高于A組的(10.23±0.21)％，和B組的(10.10±0.15)％，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=14673.22，P＜0.001)。采用Bonferroni多重比較法分別比較三組細(xì)胞數(shù)量的差異，結(jié)果顯示，C組與A組

16、(P＜0.001)和B組(P＜0.001)的CD41a+細(xì)胞百分比均有顯著性差異，而A、B兩組之間無統(tǒng)計學(xué)差異(P=1.000)。
　　 第二章:ITP患者血漿對巨核細(xì)胞的影響
　　 1.倒置顯微鏡和光學(xué)顯微鏡觀察兩組巨核細(xì)胞大體形態(tài)的差別與添加正常血漿所得巨核細(xì)胞相比，添加ITP患者血漿組所得的巨核細(xì)胞數(shù)量明顯減少，血小板產(chǎn)量減低。
　　 2.電鏡觀察兩組巨核細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的差異正常組巨核細(xì)胞的電鏡特點:呈成熟巨

17、核細(xì)胞的形態(tài)，直徑大，外形不規(guī)則。核形狀不規(guī)則，分葉，核周有異染色質(zhì)凝集。胞質(zhì)內(nèi)有大量血小板分界膜系統(tǒng)。胞質(zhì)內(nèi)有少量分散的核糖體和糙面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及大量血小板顆粒，線粒體呈小圓形。糖原顆粒豐富。ITP組巨核細(xì)胞的電鏡特點:呈未成熟巨核細(xì)胞的形態(tài)。直徑比成熟巨核細(xì)胞小，外形不規(guī)則。核大，不規(guī)則，分葉狀，核周亦有異染色質(zhì)凝集，可見核仁。胞質(zhì)內(nèi)核糖體豐富，線粒體小。高爾基復(fù)合體發(fā)育良好。血小板分界膜系統(tǒng)幼稚。
　　 3.流式細(xì)胞術(shù)分析比較兩

18、組巨核細(xì)胞數(shù)量的差異巨核細(xì)胞特異性表面抗原CD41a的檢測:根據(jù)FSC、SSC圈出巨核細(xì)胞群，分析CD41a+細(xì)胞所占比例。比較兩組巨核細(xì)胞百分比，數(shù)據(jù)方差不齊，故因此采用非參數(shù)檢驗中的Mann-WhitneyU檢驗進(jìn)行統(tǒng)計分析。結(jié)果顯示ITP組24例血漿孵育下所得巨核細(xì)胞百分比為(11.89±1.62)％，明顯低于10例正常血漿孵育下所得巨核細(xì)胞百分比(33.61±3.24)％，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Z=-4.536，P＜0.001)。<

19、br>　　 4.基因芯片分析兩組巨核細(xì)胞miRNAs表達(dá)差異對ITP患者血漿孵育所得巨核細(xì)胞與正常血漿孵育所得巨核細(xì)胞的miRNAs分子進(jìn)行基因表達(dá)譜分析，芯片結(jié)果顯示，有89個miRNAs分子在ITP組巨核細(xì)胞中上調(diào)，上調(diào)倍數(shù)≥2。其中上調(diào)的miRAN分子中包括has-miR-101，has-miR-124*，has-miR-30c-1*，has-miR-146a等人類miRNA分子以及hsv2-miR-H9-3p，hsv1-miR

20、-H7*，ebv-miR-BART19-3p,hsv2-miR-H24,hsv2-miR-H10,hsv1-miR-H17,hsv1-miR-H8*,ebv-miR-BART6-3p,hsv1-miR-H14-3p,ebv-miR-BART8*,sv40-miR-S1-5p,ebv-miR-BHRF1-2,hsv2-miR-H7-3p,hsv2-miR-H6等14個病毒miRNA分子。有63個miRNAs分子在ITP組下調(diào)，下調(diào)倍數(shù)≥2

21、。其中包括has-miR-17,has-miR-106a,has-miR-106b*,has-miR-126*,has-miR-128等人類miRNA分子。下調(diào)的miRNA分子中沒有病毒miRNA分子。
　　 5.QRT-PCR對表達(dá)差異的miRNAs分子進(jìn)行驗證從ITP組上調(diào)的miRNAs分子中篩選出miR-146a進(jìn)行驗證實驗。采用單樣本t檢驗分析數(shù)據(jù)。結(jié)果顯示，ITP組細(xì)胞中miR-146a的相對表達(dá)量為正常組的3.71±

22、0.65倍，兩者差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=20.549，P＜0.001)。這與基因芯片的結(jié)果是一致的。再利用24例ITP患者血漿和10正常人血漿直接逆轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行血漿的QRT-PCR驗證實驗，采用單樣本t檢驗分析數(shù)據(jù)。結(jié)果顯示，ITP組血漿中miR-146a的相對表達(dá)量為正常組的3.06±0.75倍，兩者差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=13.430，P＜0.001)。這和細(xì)胞中miR-146a的表達(dá)結(jié)果是一致的。
　　 第三章:病毒miRNAs

23、與ITP
　　 芯片結(jié)果顯示的在ITP組中上調(diào)的6個病毒miRNAs分子中，除了ebv-miR-BART6-3p在兩組細(xì)胞中的表達(dá)無差異(t=3.495，P=0.073)之外，ebv-miR-BART19-3p、hsv1-miR-H7*、hsv1-miR-H8*、hsv1-miR-H14-3p和hsv2-miR-H7-3p均在ITP組表達(dá)上調(diào)，各自的相對表達(dá)量均顯著高于正常組巨核細(xì)胞(P＜0.05)。這和基因芯片的結(jié)果是一致的。

24、
　　 結(jié)論:
　　 1.SCF+TPO+IL-3+IL-6的細(xì)胞因子組合可較好地刺激臍血單個核細(xì)胞體外定向擴(kuò)增為巨核細(xì)胞。
　　 2.ITP患者血漿在體外能使巨核細(xì)胞數(shù)量降低，成熟障礙。
　　 3.添加正常血漿和ITP血漿后，培養(yǎng)所得的兩組巨核細(xì)胞有明顯miRNAs分子表達(dá)差異。提示某些miRNAs分子有調(diào)節(jié)巨核細(xì)胞生成的作用。
　　 4.病毒miRNAs可能通過調(diào)節(jié)巨核細(xì)胞生成來參與ITP的發(fā)