ITP血漿及脾臟CD8+T細胞對巨核細胞發(fā)育和血小板生成的影響及機制探討.pdf

1、原發(fā)免疫性血小板減少癥(primaryimmunethrombocytopenia,ITP)是臨床最常見的自身免疫性出血性疾病,約占所有出血性疾病的1/3。以血小板減少、體內(nèi)出現(xiàn)血小板自身抗體、骨髓巨核細胞數(shù)正常或增多為主要臨床特點。近年來,盡管出現(xiàn)了利妥昔單抗、TPO受體激動劑等新的治療方法,但仍有約1/3的患者治療無效或短期內(nèi)復發(fā),成為難治性ITP。
　　 本病發(fā)病機制復雜,至今尚未完全闡明。長期以來由自身反應性B細胞產(chǎn)生的

2、自身抗體,主要是針對自身血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa和/或(Ⅰ)b/(Ⅰ)X抗原的自身抗體,尤其是IgG抗體對血小板的破壞被認為是ITP的主要病因。血小板的大量破壞本應引起血小板生成的代償性增加,但血小板動力學研究發(fā)現(xiàn)2/3的ITP患者血小板生成減少或生成正常。提示血小板生成減少可能也參與了ITP的發(fā)病。
　　 最近,體外研究顯示ITP患者血漿中的自身抗體能夠抑制巨核細胞的生長發(fā)育及成熟,說明血小板特異性自身抗體不僅介導外周血小板破

3、壞,還對骨髓中巨核細胞有影響。但是多數(shù)ITP患者骨髓中巨核細胞數(shù)量正常或增多,其血小板生成減少不能用巨核細胞數(shù)量降低解釋。目前普遍認為血小板的生成與巨核細胞成熟、凋亡密切相關。因此,巨核細胞凋亡異常有可能導致ITP患者血小板持續(xù)減少。
　　 隨著對ITP發(fā)病機制的深入研究,細胞免疫功能失調(diào)在ITP發(fā)病中的作用越來越受重視。研究發(fā)現(xiàn)ITP患者外周血CD8+細胞增多,CD4+/CD8+下降。Olsson等應用基因芯片技術發(fā)現(xiàn)在ITP

4、患者中與細胞毒作用有關的基因以及與Th1細胞反應有關的基因表達增高,提示細胞介導的細胞毒作用可能在ITP發(fā)病中起重要作用。隨后,Olsson等和張峰等的體外實驗證實細胞毒性T淋巴細胞(cytotoxicTlymphocyte,CTL,CD8+T)能直接參與對ITP患者血小板的殺傷,導致血小板持續(xù)破壞。血小板由巨核細胞凋亡產(chǎn)生,巨核細胞與血小板表面具有相同的標記物,細胞毒性T淋巴細胞可能對巨核細胞也具有直接的殺傷作用。
　　 我們

5、首先將ITP患者血漿與正常臍血來源的CD34+細胞在體外共同孵育,定向擴增巨核細胞,觀察ITP患者血漿對巨核細胞發(fā)育和血小板生成的影響。我們還將ITP鼠脾臟CD8+T細胞與BALB/c小鼠骨髓巨核細胞或巨噬細胞系PU5-1.8細胞在體外共同孵育,觀察CD8+T細胞對巨核細胞的毒性殺傷作用。
　　 第一部分ITP患者血漿對體外巨核細胞發(fā)育和血小板生成的影響及機制探討
　　 目的:
　　 研究ITP患者血漿對體外臍血

6、來源的巨核細胞生長發(fā)育以及培養(yǎng)體系中血小板生成的影響,探討血漿中抗體以外因素在ITP中的可能機制。
　　 方法:
　　 ◆采集49例ITP患者血漿以及22例正常對照血漿。
　　 ◆采集足月妊娠臍血80-100ml,分離單個核細胞并從中分選出CD34+細胞,加入重組人血小板生成素(recombinanthumanthrombopoietin,rhTPO)、重組人白細胞介素-3(recombinanthumanint

7、erleukin,rhIL-3)、人干細胞因子(stemcellfactor,SCF)體外培養(yǎng)于24孔培養(yǎng)板中,每孔加入100μ(l)正常對照或ITP患者血漿。
　　 ◆流式細胞術檢測培養(yǎng)體系中巨核細胞的數(shù)量及凋亡、血小板生成情況以及巨核細胞中Fas、FasL、TRAIL、TRAIL-R2、Caspase-3、Caspase-8的表達。流式細胞術檢測生成的血小板表面TRAIL的表達。
　　 ◆酶聯(lián)免疫吸附實驗(enzym

8、e-linkedimmunoadsorbentassay,ELISA)法檢測ITP患者/正常對照血漿或細胞培養(yǎng)上清液中TPO、IL-11、sFas、sTRAIL水平。
　　 結(jié)果:
　　 ◆多數(shù)ITP患者血漿抑制體外巨核細胞凋亡,培養(yǎng)體系中巨核細胞數(shù)目增多而血小板生成減少
　　 細胞培養(yǎng)第15天,與對照組血漿孵育下產(chǎn)生的巨核細胞(均數(shù)±標準差5.10±0.90×105)相比,26例ITP患者血漿孵育下的CD41a

9、+細胞數(shù)顯著高于對照(7.13±0.86×105,P＜0.0001),定義為A組;14例ITP患者血漿孵育下的CD41a+細胞數(shù)顯著低于對照(2.83±1.02×105;P＜0.0001),定義為B組;另9例ITP患者血漿孵育下的CD41a+細胞與對照組無顯著差異(5.20±0.66×105;P=0.776),定義為C組。
　　 A組巨核細胞凋亡明顯受抑(21.88％±3.53％),顯著低于對照組(29.43％±3.80％;P＜

10、0.0001)。而B組(27.36％±4.31％)、C組(28.21％±4.02％)巨核細胞凋亡與正常對照組無差異。
　　 A組(7.51±2.41×103)和B組(7.21±2.45×103)血小板數(shù)目均顯著低于正常對照(11.21±1.82×103)和C組(10.12±1.91×103)(P＜0.0001)。
　　 ◆在A組ITP患者血漿作用下,體外培養(yǎng)的巨核細胞中TRAIL,caspase-8以及caspase-3

11、表達降低
　　 細胞培養(yǎng)第6天,巨核細胞中TRAIL,caspase-8以及caspase-3的表達在各組間無差異;而在細胞培養(yǎng)第10和14天時,A組中TRAIL,caspase-8以及caspase-3的表達顯著低于對照,B、C組與對照組無顯著差異。另外,A組中TRAIL,caspase-8以及caspase-3的表達降低與巨核細胞凋亡減少以及血小板生成減少相關。
　　 巨核細胞表面Fas以及FasL的表達較低,且在各

12、組間無差異;巨核細胞表面TRAIL-R2的表達以及生成的血小板表面TRAIL的表達均比較穩(wěn)定,且在各組間無差異。
　　 ◆在A組ITP患者血漿的作用下,體外培養(yǎng)的巨核細胞中Bcl-xL表達增高細胞培養(yǎng)第8天及第15天,A組巨核細胞中Bcl-xL水平(82.29％±5.02％,72.57％±5.28％)均顯著高于對照組(51.02％±4.77％,47.34％±5.87％;P＜0.0001)。而另一抗凋亡因子Bcl-2在各組間無顯著

13、差異。
　　 ◆血漿中IL-11以及TPO水平在各組間無明顯差異
　　 A組血漿中IL-11水平顯著高于對照組(126.74±44.23pg/mlvs31.19±9.20pg/ml;P＜0.0001),但IL-11在A、B、C三組ITP血漿間無顯著性差異。血漿TPO水平在A、B、C三組以及對照組間無明顯差異。
　　 ◆A組血漿以及細胞培養(yǎng)上清液中sTRAIL水平降低
　　 血漿中sTRAIL的含量在A組為

14、2343.24±1155.81pg/ml,顯著低于對照組(5653.37±1583.32pg/ml,P＜0.0001).細胞培養(yǎng)第6、10、14天時檢測細胞培養(yǎng)上清液中sTRAIL的含量,A組分別為1200.67±321.49,585.59±277.98,373.65±272.51pg/ml;顯著低于對照組(2347.18±479.40,1257.13±329.24,852.32±307.32pg/ml,P＜0.0001).B、C兩組上

15、清液中sTRAIL的含量在任何檢測時間點與對照組均無差異。
　　 血漿sFas的含量在各組間無顯著差異。在細胞培養(yǎng)第6和10天時,A組培養(yǎng)上清中sFas的含量分別為127.38±18.28和137.72±25.67pg/ml,顯著低于對照(163.75±23.21;178.68±17.40pg/ml,P＜0.0001).而在第14天時,各組間無差異。A、B、C三組上清液中sFas的含量在任何檢測時間點均無差異。
　　 結(jié)

16、論:
　　 ◆大多數(shù)ITP患者血漿在體外能夠抑制巨核細胞凋亡,使巨核細胞數(shù)量增加而血小板生成減少。
　　 ◆巨核細胞數(shù)量增加并非由于TPO和IL-11的血漿水平升高引起。
　　 ◆凋亡相關因子TRAIL以及Bcl-xL在巨核細胞中的異常表達與巨核細胞凋亡減少以及血小板生成減少相關。
　　 第二部分ITP鼠脾臟CD8+T細胞對體外巨核細胞的毒性殺傷作用
　　 目的:
　　 研究ITP鼠脾臟C

17、D8+T細胞對體外培養(yǎng)的BALB/c小鼠骨髓巨核細胞以及巨噬細胞系PU5-1.8細胞、淋巴細胞系EL-4細胞的毒性殺傷作用,探討細胞毒性T細胞直接殺傷巨核細胞在ITP發(fā)病機制中的作用。
　　 方法:
　　 ◆提取BALB/c小鼠骨髓細胞,加入重組小鼠血小板生成素（recombinantmousethrombopoietin,rmTPO)體外培養(yǎng)7-8天。瑞氏染色觀察小鼠骨髓巨核細胞形態(tài),流式細胞術檢測小鼠骨髓巨核細胞表面

18、CD61、H2-Kd的表達。
　　 ◆體外培養(yǎng)巨噬細胞系PU5-1.8細胞和淋巴細胞系EL-4細胞,流式細胞術檢測PU5-1.8細胞和EL-4細胞表面CD61、H2-Ka/H2-Kb的表達。
　　 ◆構(gòu)建ITP小鼠模型:野生型BALB/c小鼠血小板或野生型C57BL/6小鼠血小板(100×106)免疫BALB/cCD61KO小鼠,一周一次,連續(xù)免疫2-4周后,檢測BALB/cCD61KO小鼠血漿中IgG抗體的含量,IgG

19、抗體(1/2000)陽性后可取BALB/cCD61KO小鼠脾細胞,腹腔注射聯(lián)合免疫缺陷鼠(SevereCombinedImmunodeficient,SCID)。每周觀測SCID鼠血小板數(shù)目,血小板計數(shù)＜400×109/1,即為ITP模型鼠。
　　 ◆提取ITP鼠脾臟細胞并從中分選出CD8+T細胞和/或CD19+B細胞。
　　 ◆細胞毒性實驗:以體外培養(yǎng)的BALB/c小鼠骨髓巨核細胞或巨噬細胞系PU5-1.8細胞為靶細胞

20、;以不同種屬血小板(BALB/c血小板或C57BL/6血小板)免疫的ITP鼠脾細胞(全脾細胞、去除CD8+T細胞的脾細胞、去除CD19+B細胞的脾細胞)為效應細胞(對照組效應細胞為野生型BALB/c小鼠脾細胞)。將效應細胞與靶細胞按照不同的細胞比例(E∶T=20∶1、10∶1、5∶1、2.5∶1等)在體外共同培養(yǎng)4小時,流式細胞術檢測巨核細胞的死亡率。
　　 結(jié)果:
　　 ◆體外培養(yǎng)的骨髓巨核細胞多為成熟多倍體細胞,表面

21、高表達CD61、H2-KdBALB/c小鼠骨髓細胞在含TPO的巨核細胞培養(yǎng)液中體外培養(yǎng)7天后,多數(shù)已發(fā)育為成熟多倍體巨核細胞(N≥4)。絕大多數(shù)巨核細胞表面同時表達CD61和H2-Kd。巨核細胞表面CD61的表達率為85.7％,MHCⅠ類分子H2-Ka的表達率為99.69％。
　　 ◆PU5-1.8細胞和EL-4細胞表面高表達CD61、MHCⅠ類分子H2-Kd或者H2-Kb
　　 對于PU5-1.8細胞來說,不管其吞噬血

22、小板與否,也不管其吞噬的血小板是否被活化,PU5-1.8細胞表面均高表達CD61分子和MHCⅠ類分子(H2-Kd)。部分EL-4細胞表面也表達CD61和MHCⅠ類分子H2-Kb。體外培養(yǎng)的EL-4細胞表面CD61的表達率為48.87％,MHCⅠ類分子H2-Kb的表達率為99.33％。
　　 ◆BALB/c小鼠血小板免疫的同種CD61KO鼠脾細胞(同種免疫組)對體外培養(yǎng)的巨核細胞和PU5-1.8細胞具有殺傷作用,CD8+T細胞是起

23、主要殺傷作用的效應細胞
　　 BALB/c小鼠血小板免疫的同種CD61KO鼠脾細胞(同種免疫組)對體外培養(yǎng)的巨核細胞和PU5-1.8細胞均具有明顯的殺傷作用,且此殺傷作用隨E∶T(效應細胞∶靶細胞)比值增高而變強;而C57BL/6小鼠血小板免疫的BALB/cCD61KO鼠脾細胞(異種免疫組)對靶細胞的作用與對照組無明顯差異。進一步將同種免疫組脾細胞中的CD8+T細胞去除后(CD8+T去除組)發(fā)現(xiàn)其對PU5-1.8細胞的殺傷作用明