人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶上調(diào)CDX2表達(dá)促進(jìn)胃黏膜腸化生的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:
　　胃黏膜癌變是一個(gè)漸進(jìn)的過程,往往要經(jīng)歷從腸上皮化生→異型增生→早期胃癌→進(jìn)展期胃癌。如果能在癌前階段進(jìn)行早期有效干預(yù),或可阻斷胃黏膜癌變的發(fā)生。胃黏膜腸上皮化生(intestinal metaplasia,IM)作為胃黏膜癌前期病變的一種,越來越受到重視。端粒酶(telomerase)是一種核糖核酸酶,具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性,是細(xì)胞永生化和無限增殖的重要條件。人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(human telomerase reverse

2、 transcriptase, hTERT)作為端粒酶的主要限速成份,其表達(dá)的強(qiáng)度與端粒酶活性一致。因此,hTERT的表達(dá)可以作為衡量端粒酶活性的指標(biāo)。研究表明,在胃黏膜癌變過程中,隨著胃黏膜癌變程度的加重,端粒酶及其hTERT單位的表達(dá)明顯增強(qiáng);在腸化上皮中,亦發(fā)現(xiàn)隨著腸化程度的增加,端粒酶及其hTERT的表達(dá)亦逐漸增強(qiáng),提示hTERT的表達(dá)可能參與了腸上皮化生的過程,但其確切機(jī)制不明。本研究hTERT在胃黏膜腸化生的作用及其可能存在

3、的分子機(jī)制。
　　方法:
　?、挪捎脤?shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(quantitative real-time polymerase chain reaction, qPCR)檢測腸化生與正常胃黏膜組織中hTERT、CDX2的表達(dá)變化;
　?、撇捎妹庖呓M化染色檢測腸化生與正常胃黏膜組織中hTERT、CDX2以及MUC2的表達(dá)變化;
　　⑶采用qPCR技術(shù)篩選細(xì)胞轉(zhuǎn)染hTERT后,檢測腸化生相關(guān)基因CDX1、CDX2

4、以及CDX4的表達(dá)變化,進(jìn)一步Western-Blot驗(yàn)證其蛋白水平變化;
　?、炔捎胵PCR技術(shù)驗(yàn)證細(xì)胞干擾hTERT后,檢測CDX2表達(dá)變化,進(jìn)一步Western-Blot驗(yàn)證其蛋白水平變化;
　?、刹捎肅o-IP驗(yàn)證hTERT與p65相互作用;
　?、什捎胵PCR、Western-Blot、以及雙熒光素酶技術(shù)驗(yàn)證,NF-κB抑制劑(Bay78-1105)在hTERT對(duì)CDX2的上調(diào)作用中的影響;
　　⑺采用

5、qPCR、雙熒光素酶技術(shù)驗(yàn)證轉(zhuǎn)染p65后,KLF4表達(dá)變化;
　?、滩捎胵PCR、Western-Blot、以及雙熒光素酶技術(shù)驗(yàn)證轉(zhuǎn)染hTERT后,KLF4表達(dá)變化,免疫組化證實(shí)腸化生與正常胃黏膜組織中KLF4表達(dá)情況;
　?、筒捎秒p熒光素酶技術(shù)驗(yàn)證,干擾KLF4在hTERRT對(duì)CDX2的上調(diào)中的作用;
　　⑽采用Western-Blot技術(shù)驗(yàn)證,干擾p65,在hTERT對(duì)CDX2上調(diào)作用中的影響;⑾采用Co-IP驗(yàn)證

6、hTERT與c-Rel、p50的相互作用;⑿采用qPCR、雙熒光素酶技術(shù)驗(yàn)證轉(zhuǎn)染p65和p50后,CDX2表達(dá)變化。
　　研究結(jié)果:
　　一、hTERT與胃黏膜腸化生密切相關(guān)
　?、拍c化生組織qPCR結(jié)果表明,hTERT和CDX2 mRNA水平均上調(diào);
　?、圃谀c化生組織中,免疫組化研究表明,hTERT表達(dá)上調(diào),CDX2表達(dá)上調(diào),杯狀細(xì)胞特異性MUC2蛋白也上調(diào);
　　⑶過表達(dá)和干擾hTERT后,CDX2

7、mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯上調(diào)和降低,提示 hTERT可能通過調(diào)控 CDX2的表達(dá)而參與腸化生過程。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示:hTERT與胃黏膜腸化生密切相關(guān),可能參與了腸化生的發(fā)生。
　　二、hTERT通過p65-KLF4通路上調(diào)腸化型胃癌細(xì)胞CDX2表達(dá)
　?、磐ㄟ^Co-IP驗(yàn)證hTERT與p65存在蛋白-蛋白相互作用,并促進(jìn)磷酸化p65的表達(dá),提示hTERT可以與p65結(jié)合并加強(qiáng)其對(duì)下游基因的轉(zhuǎn)錄作用;
　?、泼庖呓M化證

8、實(shí) hTERT高表達(dá)的腸化生組織中 KLF4表達(dá)明顯增加,過表達(dá)hTERT可以上調(diào)KLF4以及mRNA、蛋白以及啟動(dòng)子活性;
　?、峭ㄟ^NF-κB抑制劑及shRNA干擾p65,能抑制hTERT對(duì)CDX2、KLF4的上調(diào)作用;
　　⑷ sh-KLF4干擾能抑制hTERT對(duì)CDX2的上調(diào)作用。
　　上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示p65-KLF4-CDX2通路參與了胃黏膜腸上皮化生的發(fā)生。
　　三、hTERT通過c-Rel/p50通

9、路上調(diào)CDX2表達(dá)
　?、鸥蓴_p50能有效抑制hTERT對(duì)CDX2的上調(diào)作用;
　?、七^表達(dá)p50后,CDX2 mRNA、蛋白和啟動(dòng)子活性升高;
　　⑶采用Co-IP實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,hTERT既能與c-Rel,又能與p50存在蛋白-蛋白相互作用。
　　以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示hTERT過能與c-Rel/p50形成三聚體調(diào)控CDX2的表達(dá),促進(jìn)胃黏膜腸上皮化生的發(fā)生。
　　結(jié)論:
　　在胃黏膜化生過程中, hTE