端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶基因修飾人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、7 b 鴨h @ 8 2 ＼0 0 莖蒜霎霉嵩密 級 公開鄭州 大學(xué)碩士學(xué)位論文論文題目：作者姓名：學(xué)科門類：專業(yè)名稱：導(dǎo)師姓名、職稱：端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶基因修飾人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究李 克醫(yī) 學(xué)生理學(xué)邢瑩教授二零零五年五月二十五日塑型查蘭! ! 墮蘭堡主型窒生望些熊奎 塑塹墮望壁墨墼苧墮壁銎△堂塑囹壟．墾王塑盟莖墮里墮目的：觀察外源性h T E R T 基因的異位表達(dá)對人骨髓間充質(zhì)= l = 細(xì)胞( m e s e n c h y

2、m a ls t e mc e l l ，M S C ) 端粒酶活性及細(xì)胞生命周期的影響。方法：1 ．將攜帶有增強(qiáng)型綠色熒光蛋l(fā) ! 芻( e n h a n c e d g r e e n f l u o r e s c e n tp r o t e i n ，E G F P ) 報告基因和人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶( h u m a n t e l o m e r a s e r e v e r s e t r a n s c r i p t

3、 a s e ，h T E R T ) 目的基因的質(zhì)粒D E G F P ．h T E R T 通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)入人骨髓M S C s 中，并用G 4 1 8 進(jìn)行陽性克隆的篩選和擴(kuò)增。2 ．通過R T - P C R 和P C R - E L I S A 對轉(zhuǎn)染前后h T E R T m R N A 的表達(dá)情況及其對端粒酶活性的影響進(jìn)行檢測，并對轉(zhuǎn)染細(xì)胞的染色體核型進(jìn)行分析。3 ．將轉(zhuǎn)染細(xì)胞在重組人E G F 和b F G F 的聯(lián)

4、合誘導(dǎo)下向神經(jīng)元樣細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化，并用R T - P C R 進(jìn)行鑒定。結(jié)果：1 ．轉(zhuǎn)染3 6 h 在熒光顯微鏡下觀察到綠色熒光并持續(xù)1 個月以上。通過R T - P C R 檢測表明，未轉(zhuǎn)染的入骨髓M S C s 的h T E R T m R N A 表達(dá)陰性，而轉(zhuǎn)h T E R T 的入M S C s 的h T E R T m R N A 表達(dá)陽性，通過P C R - E L I S A 檢測表明，未轉(zhuǎn)染的人骨髓M S C s 的

5、端粒酶為陰性，而轉(zhuǎn)染h T E R T 的人骨髓M S C s 的端粒酶則呈陽性。2 ．轉(zhuǎn)染h T E R T 的人骨髓M S C s 在體外已連續(xù)傳到第3 5 代且保持正常二倍體核型，而未轉(zhuǎn)染的人骨髓M S C s 傳到第2 0 ～2 5 代左右已衰老死亡。3 ．轉(zhuǎn)染h T E R T 的人骨髓M S C s 經(jīng)E G F 和b F G F 的聯(lián)合誘導(dǎo)后，較多細(xì)胞出現(xiàn)了典型的神經(jīng)元樣形態(tài)，且經(jīng)R T - P C R 檢測表明，神經(jīng)元特

6、征性蛋白微管相關(guān)蛋白( m i c r o t u b u l ea s s o c i a t e p r o t e i n ，M A P 2 ) 和神經(jīng)絲亞單位M ( n e u r o f l i a m e n ts u b u n i t M ，N F - M )表達(dá)增強(qiáng)。結(jié)論：1 ．外源性h T E R T 基因可以在人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中獲得異位表達(dá)，并能誘導(dǎo)人骨髓問充質(zhì)干細(xì)胞的端粒酶活性。2 ．外源性h T E R T