慢病毒介導的RNA干擾肺癌端粒酶逆轉錄酶研究.pdf

1、研究背景與目的：
　　在我國，所有惡性腫瘤的發(fā)病率和死亡率中，肺癌均位于首位。盡管目前肺癌的治療方法打破了傳統(tǒng)的單一治療模式，形成了多學科綜合治療方案，但肺癌總的5年生存率僅為5％-10%，因此學者們在努力探索新的療法，努力改善這一現狀。
　　近年來研究發(fā)現端粒酶與肺癌的發(fā)生發(fā)展關系密切。端粒酶是由RNA組分和蛋白組分組成的核糖核蛋白復合體，其中端粒酶逆轉錄酶（human telomerase reverse transcr

2、iptase，hTERT）是端粒酶的主要成分，是端粒酶發(fā)揮活性和細胞癌變的限速因素，因而有望成為肺癌治療的全新靶點。
　　利用RNA干擾（RNA interference，RNAi）技術，由小干擾RNA（small interference RNA，siRNA）在轉錄后水平特異性降解靶基因，進而抑制異常蛋白的表達，最終達到調控細胞生長的目的。
　　本研究針以hTERT mRNA基因為靶點，通過構建慢病毒介導的siRNA表達載

3、體，轉染到肺癌A549細胞，利用Real Time RT-PCR技術、western blot技術、MTT技術、流式細胞技術，探討慢病毒介導的siRNA針對肺癌細胞中hTERT mRNA、hTERT表達水平的下調以及對A549細胞增殖、凋亡的影響。
　　研究內容和方法：
　　1.重組siRNA表達載體，結合慢病毒載體pGCSIL-GFP的結構，設計并合成四條互補的DNA oligo，把DNA oligo克隆進慢病毒載體——p

4、GCSIL-GFP的U6啟動子下游，通過基因測序法鑒定所構建的siRNA表達載體。
　　2.用Real Time RT-PCR技術、western blot技術檢測siRNA轉染后hTERT mRNA、hTERT表達水平的變化情況。
　　3.用MTT法、流式細胞術評價轉染siRNA后對肺癌細胞增殖、凋亡的影響。
　　結果：
　　1.基因測序證實插入序列符合設計要求。成功構建了siRNA表達載體。
　　2.與

5、NC-siRNA組相比，hTERT-siRNA組hTERT mRNA、hTERT表達量顯著下降，72h最高，抑制率分別為的（75.06±5.04）%、（55.74±3.30）%。
　　3.與NC-siRNA組相比，hTERT-siRNA組細胞增殖能力降低，抑制率為49.67±5.88%，
　　4.與NC-siRNA組相比，hTERT-siRNA組細胞凋亡增加，凋亡率為31.51±1.59%
　　結論：
　　1.成