人端粒酶逆轉錄酶基因rnai表達載體的構建、鑒定

1、<p>　　人端粒酶逆轉錄酶基因RNAi表達載體的構建、鑒定</p><p>　　作者：毛立軍，鄭駿年，李望，鄭宏祥，劉俊杰，孫曉青，陳家存，溫儒民 </p><p>　　【關鍵詞】 重組質粒 </p><p>　　摘要 :目的 構建端粒酶逆轉錄酶（hTERT）基因的RNA干擾（RNAi）表達載體。 方法 化學合成能編碼針對hTERT基因的短發(fā)夾R

2、NA（shRNA）序列的寡核苷酸，退火處理后克隆到pSilencer1.0-U6shRNA表達載體的U6RNA聚合酶Ⅲ（PolⅢ）啟動子的下游，構建重組RNAi質粒pSliencer-hTERT。 結果 經(jīng)酶切電泳及測序分析證實，目的序列成功插入到預計位點。 結論 已成功構建pSliencer-hTERT載體，為進一步研究其對端粒酶活性的抑制作用打下基礎。 </p><p>　　關鍵詞 :RNA干擾;短發(fā)夾R

3、NA;人端粒酶轉錄酶;重組質粒; </p><p>　　Abstract:Objective To construct the expressing vector of small hairpin RNA（shRNA）targeting human telomerase re-verse transcriptase（hTERT）gene.Methods Two template DNA oligonucleoti

4、des for shRNA expression targeted hTERT gene were chemically synthesized.The annealed shRNA templates were processed to produce and identify the recombinant RNAi plas-mid sPilencer-hTERT.Results It was demonstrated that

5、shRNA template targeting hTERT gene had been inserted at the ex-pected site and the insertion sequen</p><p>　　Key words:RNA interference;small hairpin RNAs;human telomerase reverse transcriptase;recombinant

6、plasmid </p><p>　　端粒酶的活化與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關，通過激活端粒酶，端粒DNA得以延長使細胞永生。端粒酶逆轉錄酶（hTERT）是催化這一反應的惟一限速酶，因此有希望成為腫瘤治療的理想靶點。RNA干擾是近年迅速發(fā)展起來的一項新的基因阻斷技術，能特異、高效地阻抑靶基因表達，有望成為腫瘤基因治療的有力工具［1］。本實驗將針對hTERT mRNA的小干擾RNA（siRNA）模板插入siRNA

7、表達載體，構建載體hTERT-siRNA表達載體，為進一步研究其對端粒酶活性的抑制作用打下基礎。 </p><p><b>　　1 材料和方法 </b></p><p>　　1.1 主要試劑 pSilencer1.0-U6質粒為美國Am-bion公司產(chǎn)品，大腸桿菌JM109由徐州醫(yī)學院生物化學教研室保存。T4DNA連接酶以及小量質粒提取試劑盒購自Promega公司，

8、限制性內切酶BamHⅠ 和HindⅢ購自MBI公司。 </p><p><b>　　1.2 實驗方法 </b></p><p>　　1.2.1 模板DNA合成 選擇2段hTERT mRNA的序列作為RNA干擾的靶序列，序列一針對的是hTERT基因顯性失活突變體區(qū)（NM003219:堿基序列位置2182-2200）。序列二采用Ambin公司的網(wǎng)上設計軟件（www.am

9、bion.com）進行設計，所對應的的靶序列為hTERT（NM003219:747-765）。設計2對編碼短發(fā)夾RNA序列的DNA單鏈。序列一:P1:5′-CAAGGTGGATGTGACGGGCTTCAAGAGAGCCC-GTCACATCCACCTTGTTTTTT-3′，P2:5′-AATTAA-AAAAGCCCGTCACATCCACCTTGTCTCTTGAACAAG-GTGGATGTGACGGGCGGCC-3′。序列二:P1:5′-G

10、TCTGCCGTTGCCCAAGAGTTCAAGAGACTCTTGGG-CAACGGCAGACTTTTTT-3′，P2:5′-AATTAAAAA-AGTCTGCCGTTGCCCAAGAGTCTCTTGAACTCTTGG-GCAACGGCAGACGGCC-3′。其順序為ApaⅠ酶切位點、19nt正義序列、9nt loop接頭</p><p>　　1.2.2 質粒pSilencer-hTERT表達載體的構建 <

11、/p><p>　　1.2.2.1 寡核苷酸的退火 將合成的模板寡核苷酸溶解在100μl無核酶水中，取1μl用TE（10mmol.LTris，1mmol.L EDTA）稀釋，使終濃度為1g.L。取正義模板鏈、反義模板鏈各2μl加入46μl的退火緩沖液，在90℃孵育3min，37℃孵育1h。退火后形成的雙鏈用3%凝膠電泳，以10倍稀釋的合成的單正鏈為對照，檢測退火前后電泳圖譜是否有變化。 </p><

12、p>　　1.2.2.2 寡核苷酸與pSilencer1.0-U6連接 將針對不同hTERT序列的2對退火后的模板鏈與pSi-lencer1.0-U6線性表達載體連接，重組后的載體命名為pSilencer-hTERT1、pSilencer-hTERT2。按下列操作進行:取5μl退火后的模板鏈用45μl無核酶水稀釋成終濃度8mg.L，建立10μl反應體系:1μl上述稀釋退火模板鏈、6μl無核酶水、1μl10×T4DNA連接酶

13、緩沖液、1μl pSilencer1.0-U6、1μl T4DNA連接酶（5U.μl）。16℃孵育過夜。將重組載體轉化感受態(tài)細胞JM109后提取質粒。 </p><p>　　1.2.3 陽性克隆鑒定 </p><p>　　1.2.3.1 酶切鑒定 用BamHⅠ或HindⅢ單酶切重組質粒，所有各管于37℃水浴過夜。取7μl樣品在1%瓊脂糖凝膠和TAE緩沖液中80V電泳0.5h觀察結果。陽性克

14、隆應該不能夠被HindⅢ單酶切，但可被BamHⅠ切出大約370bp的小條帶。 </p><p>　　1.2.3.2 測序鑒定 將BamHⅠ和HindⅢ酶切后電泳出現(xiàn)大約370bp的陽性重組質粒送到上海英俊生物工程有限公司測序。 </p><p><b>　　2 結果 </b></p><p>　　2.1 退火寡核苷酸與單鏈寡核苷酸電泳結果 從

15、電泳圖（圖1）可見，退火前后寡核苷酸電泳圖譜明顯不同。Lane1條帶位置在100bp之前，約60bp左右。Lane2電泳圖譜出現(xiàn)3條帶，前面的2條與Lane4的2條帶相似，前面的應該是單鏈寡核苷酸，后面的可能是2條單鏈的自身的連接，另一條帶在100bp位置上，可能是單鏈自身折疊形成了發(fā)夾結 構，雖然分子量縮小，但由于發(fā)夾結構這種構象的改變，導致了電泳遷移速率放慢。Lane3與Lane1相似，而Lane4出現(xiàn)2條帶，前面的應該是單鏈寡核苷

16、酸，后面的可能是2條單鏈的自身的連接。從電泳圖可見序列一的單鏈自身折疊以及2條單鏈的自身的連接程度比序列一明顯得多。 </p><p>　　圖1 退火寡核苷酸與單鏈寡核酸電泳圖（略） </p><p>　　1、2分別是序列一退火后、單鏈核苷酸;3、4分別是序列二退火后、單鏈核苷酸;M為marker </p><p>　　2.2 重組質粒酶切結果 將菌落擴增后提取

17、質粒，酶切鑒定結果顯示:2條序列構成的重組質粒都不能被HindⅢ單酶切，但可被BamHⅠ切出大約350bp大小的片段（圖2）。 </p><p>　　圖2 重組質粒酶切電泳圖（略） </p><p>　　1、2分別是序列一、二的重組質粒;3、4分別為HindⅢ酶切后重組質粒;5、6分別為BamHⅠ酶切后重組質粒 </p><p>　　2.3 測序結果 由序列一構

18、成的重組的陽性RNAi載體反復測序時信號都無法通過造成測序失敗，由序列二構成的重組的陽性RNAi載體測序的結果，與我們設計合成的靶向hTERT的正義鏈完全一致，說明本實驗已把合成的寡核苷酸插入到了RNAi載體pSilencer1.0-U6siRNA中，成功構建了能靶向端粒酶hTERT基因的pSilencer1.0-U6siRNA載體。 </p><p><b>　　3 討論 </b><

19、;/p><p>　　RNA干擾（RNA interference，RNAi）是由于與靶基因序列同源的雙鏈RNA（dsRNA）引發(fā)的序列特異性轉錄后基因沉默過程，該技術已成為生物學研究進展最快的領域之一。最初是利用化學合成的siRNA實現(xiàn)RNAi，但siRNA作用時間短暫，進入細胞后很快被降解，24h后阻抑效果降低，作用持續(xù)時間約48h。為克服此缺陷，人們設想出利用載體介導siRNA體內表達技術，其原理是將siRNA對

20、應的DNA模板插入載體中位于RNA聚合酶Ⅲ啟動子下游，在RNA聚合酶Ⅲ作用下轉錄產(chǎn)生含發(fā)夾狀結構的siRNA（shRNA）［2］ 。據(jù)此，Brummelkamp［3］ 設計出針對靶基因的siRNAs的模板DNA，將其與質粒連接后轉染細胞，結果DNA模板在細胞內轉錄形成的shRNA具有與siRNA同樣的抑制靶基因表達作用，更為重要的是這種作用可持續(xù)2個月。 </p><p>　　siRNA序列的選擇常遵循如下規(guī)則:

21、其長度通常為19～21個堿基，一般從基因編碼序列或cDNA序列的起始密碼開始，向下游尋找腺苷二核苷酸（AA），標記并選擇每個AA及其下游鄰近的19個核苷酸序列一起作為siRNA的靶序列。在設計siR-NA的過程中，要避開cDNA的5′和3′非編碼區(qū)（un-translated regions，UTRs）以及5′起始密碼區(qū)附近50～100個核苷酸的序列，因為在這些區(qū)域含有豐富的蛋白結合位點，結合的調節(jié)蛋白以及形成的翻譯起始復合物等可以影響

22、siRNA與dsRNA誘導的沉默復合體（RNA induced silencing complex，RISC）結合到靶mRNA上［4］ 。所選擇的siRNA序列必須進行全基因組掃描（BLAST）和序列同源分析。 </p><p>　　本實驗設計的siRNA模板序列順序為:正義鏈 （19nt）―loop環(huán)區(qū)（TTCAAGAGA）―反義鏈（19nt）―RNA聚合酶Ⅲ終止子（TTTTTT）。所用載體為:當其插入pSil

23、encer1.0-U6線性化質粒U6啟動子下游后，在RNA聚合酶Ⅲ作用下轉錄產(chǎn)生含發(fā)夾狀結構的siRNA，當轉錄至模板上的一連串T時轉錄終止。 </p><p>　　本實驗選擇的序列二經(jīng)酶切、測序鑒定證實成功構建了hTERT siRNA表達質粒pSliencer-hTERT。采用的序列一曾被Kosciolek等［5］ 作為靶序列化學合成siRNA，并且在腫瘤細胞中證明有效。本實驗以此序列構建載體，酶切證實siRN

24、A模板已插入載體，但在重組質粒測序的過程中，反復出現(xiàn)沒有信號的現(xiàn)象，分析其原因可能是由于G.C含量過高，形成二級結構使測序信號無法通過造成的。在序列設計的過程中還要注意盡量避免G.C含量較高的序列，最好選擇在40%～45%，G.C含量超過55%時的siRNA誘導的RNAi的效果較差。 </p><p><b>　　參考文獻 : </b></p><p>　?。?］

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