急性肝衰竭大鼠腸道干預(yù)實(shí)驗(yàn)對(duì)其細(xì)菌移位、TLR4及LPS的影響.pdf

1、目的：應(yīng)用綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）標(biāo)記技術(shù)示蹤大鼠急性肝衰竭（acute liver failure，ALF）時(shí)腸道細(xì)菌移位（bacterial translocation，BT）狀況，并用天然蒙脫石進(jìn)行腸道干預(yù)，研究其對(duì)BT、血中脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）濃度及單核細(xì)胞表面Toll樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）表達(dá)的影響。

2、r>　　方法：將50只糞便中不含有氨芐抗性細(xì)菌的SD大鼠隨機(jī)分為五組：正常對(duì)照組（A）、生理鹽水對(duì)照組（B）、肝衰竭模型組（C）、天然蒙脫石（思密達(dá)）預(yù)防組（D）和天然蒙脫石（思密達(dá)）治療組（E）。A組不加干預(yù)，后四組大鼠灌飼增強(qiáng)綠色熒光蛋白（enchanced green fluorescent protein，EGFP）標(biāo)記的大腸桿菌JM109進(jìn)行示蹤，后三組大鼠用D-氨基半乳糖（D-GalN）一次性腹腔注射制備大鼠急性肝衰竭模型，

3、B組大鼠腹腔注射等量的生理鹽水。D組大鼠在造模前連續(xù)三天灌飼思密達(dá)溶液，E組大鼠在造模后連續(xù)三天灌飼思密達(dá)溶液（0.12g/次，2次/天）。應(yīng)用瓊脂糖凝膠電泳(agarose gel electrophoresis，AGE）和激光掃描共聚焦顯微鏡（laser scanning confocal microscope，LSCM）鑒定內(nèi)臟分離出的細(xì)菌是否來(lái)源于腸道；采用雙色熒光染色法，熒光素標(biāo)記的抗TLR4/抗CD14對(duì)大鼠血液?jiǎn)魏思?xì)胞表面

4、TLR4及CD14分子進(jìn)行免疫熒光染色，進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)（flow cytometry，F(xiàn)CM）檢測(cè)；采用PE標(biāo)記的抗大鼠巨噬細(xì)胞抗體，檢測(cè)組織中巨噬細(xì)胞內(nèi)GFP的平均熒光強(qiáng)度；檢測(cè)肝功能和血中LPS濃度。采用SPSS13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料統(tǒng)計(jì)學(xué)描述采用xs±。組間指標(biāo)差別檢驗(yàn)采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。若方差不齊，采用Kruskal-WallisH檢驗(yàn)，組間兩兩比較采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)，多

5、重檢驗(yàn)校正采用Bonferroni校正。P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：通過(guò)AGE，間接證實(shí)了ALF大鼠存在腸道BT；通過(guò)LSCM的觀察，直接證實(shí)了組織中的巨噬細(xì)胞吞噬了來(lái)自腸道的示蹤菌。大鼠肝功能指標(biāo)及LPS檢測(cè)結(jié)果：與正常對(duì)照組比較，生理鹽水對(duì)照組大鼠肝功能各項(xiàng)指標(biāo)及LPS的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；與正常對(duì)照組比較，模型組、思密達(dá)預(yù)防組和思密達(dá)治療組大鼠的丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanine aminot

6、ransferase，ALT）、門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartate aminotransferase，AST）、總膽紅素（total bilirubin，TBiL）和LPS增高，血清白蛋白（serum albumin，Alb）下降，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理有顯著性差異（P<0.05）。與模型組比較，思密達(dá)預(yù)防組和思密達(dá)治療組大鼠的ALT、AST、TBiL和LPS下降，Alb升高，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理有顯著性差異（P<0.05）。思密達(dá)預(yù)防組和思密達(dá)治療

7、組大鼠比較，預(yù)防組大鼠的ALT、AST、TBiL和LPS更低，差異有顯著性（P<0.01），Alb的比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.112）。大鼠血液?jiǎn)魏思?xì)胞表面TLR4的表達(dá)結(jié)果：正常對(duì)照組、生理鹽水對(duì)照組、模型組、思密達(dá)預(yù)防組和思密達(dá)治療組大鼠TLR4表達(dá)分別為328.79±31.3、347.83±29.9、554.49±40.7、478.24±31.5和522.06±29.1。正常對(duì)照組與生理鹽水對(duì)照組大鼠比較無(wú)顯著性差異（P=0.

8、20）；模型組、思密達(dá)預(yù)防組和思密達(dá)治療組與正常對(duì)照組大鼠比較，TLR4表達(dá)均顯著增高（P<0.001）；思密達(dá)預(yù)防組和思密達(dá)治療組與模型組大鼠比較，TLR4表達(dá)顯著降低（P<0.05）；思密達(dá)預(yù)防組和思密達(dá)治療組大鼠比較，TLR4表達(dá)更低（P=0.004）。各組織巨噬細(xì)胞內(nèi)GFP的平均熒光強(qiáng)度檢測(cè)結(jié)果：正常對(duì)照組與生理鹽水對(duì)照組大鼠比較，各組織間無(wú)顯著性差異（P>0.05）；模型組、思密達(dá)預(yù)防組和思密達(dá)治療組與正常對(duì)照組大鼠比較，GF