TLR4-NF-κB在低氧暴露下大鼠腸道屏障功能損傷及細(xì)菌移位中的作用研究.pdf

1、研究背景及意義：
　　急性重癥高原病(ASMS)是機(jī)體快速抵達(dá)高原后,由于低壓性缺氧導(dǎo)致組織臟器在短時(shí)間內(nèi)發(fā)生嚴(yán)重代謝功能及能量供應(yīng)障礙,并伴有明顯臨床表現(xiàn)的一組癥候群,主要包括高原肺水腫(HAPE)和高原腦水腫(HACE)。此類(lèi)疾病發(fā)展迅猛、極易導(dǎo)致擴(kuò)大的炎癥反應(yīng)、死亡率高,嚴(yán)重危及急進(jìn)高原人群的健康。雖然目前針對(duì)肺和腦本身的研究較多,但關(guān)于其發(fā)病機(jī)制至今仍然存在較大爭(zhēng)議,研究陷入了瓶頸。而對(duì)于肺外及腦外機(jī)制,卻關(guān)注較少,這為我

2、們從另一方面研究ASMS的發(fā)病機(jī)理提供了一個(gè)新的切入點(diǎn)。
　　胃腸道作為人體重要的器官,同時(shí)也是人體最大的儲(chǔ)菌庫(kù)和內(nèi)毒素庫(kù)。正常情況下,腸道粘膜的各種生理性屏障可以保證致病因素不能越過(guò)屏障侵入腸道以外的地方,TLR4/NF-κB由于其在胃腸的高表達(dá)及其特異性配體LPS在腸道細(xì)菌的廣泛存在,引起我們的關(guān)注。腸道在遭受打擊或應(yīng)激狀態(tài)下,屏障完整性被破壞,腸道就成了各種毒素和病原微生物入侵機(jī)體的門(mén)戶(hù),隨著多種炎癥介質(zhì)“瀑布樣”級(jí)聯(lián)活化效

3、應(yīng),可誘發(fā)全身炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS),進(jìn)而損傷遠(yuǎn)隔器官,形成“腸源性感染”。故目前多數(shù)學(xué)者認(rèn)為腸道在應(yīng)激時(shí),是多器官功能障礙(MODS)的始動(dòng)器官。毫無(wú)疑問(wèn),高原低壓性缺氧對(duì)機(jī)體是一種強(qiáng)烈的應(yīng)激。
　　國(guó)內(nèi)外已有的研究證實(shí),缺氧可能引起細(xì)菌的移位,而這種屏障的損傷、細(xì)菌的移位是通過(guò)何種機(jī)制,以及TLR4/NF-κB在其中是否發(fā)揮重要作用,尚未見(jiàn)報(bào)道?；谝陨媳尘?我們采用亞洲最大的低壓模擬艙群模擬高原環(huán)境,建立實(shí)驗(yàn)性高原胃腸道

4、損傷大鼠模型,以此研究低氧暴露下腸道屏障功能損傷及細(xì)菌移位的作用機(jī)制,為深入理解重癥高原病的發(fā)病機(jī)理提供新的靶點(diǎn),有重要的臨床意義。
　　研究方法：
　　1.實(shí)驗(yàn)性高原胃腸道損傷動(dòng)物模型的建立:成年健康雄性SD大鼠60只,采用隨機(jī)數(shù)字法分為平原對(duì)照組(C)、單純?nèi)毖踅M(H),并根據(jù)高原特殊氣候環(huán)境及衛(wèi)生條件下機(jī)體胃腸道疾病易感性增加的特點(diǎn),加設(shè)了單純?nèi)毖?LPS處理組(HL),每組各20只。C組置于平原環(huán)境,H組和HL組飼養(yǎng)

5、于模擬海拔7000m處,溫度25℃,光暗周期24h,HL組按計(jì)劃給藥。三組均于72h后處死取材。通過(guò)檢測(cè)腸道細(xì)菌移位、腸粘膜超微結(jié)構(gòu)改變、血清內(nèi)毒素水平等情況,綜合判定動(dòng)物模型。
　　2.TLR4/NF-κB在低氧暴露導(dǎo)致的大鼠腸道損傷中的機(jī)制探討:成年健康雄性SD大鼠100只,采用隨機(jī)數(shù)字法分為平原對(duì)照組(C)、單純?nèi)毖踅M(H)、缺氧+100mg/kg·bwPDTC組(HP)、缺氧+0.5mg/kg·bwLPS組(HL)、缺氧+

6、PDTC+LPS組(HPL),各組按既定方案給藥,并按上訴方法復(fù)制實(shí)驗(yàn)性高原胃腸道損傷動(dòng)物模型。減壓結(jié)束后(72h),平原組在平原環(huán)境取材,其余四組在模擬海拔4500m處取材。檢測(cè)各組動(dòng)物腸外組織細(xì)菌移位情況、細(xì)菌生化鑒別、腸道粘膜超微結(jié)構(gòu)改變和硝酸鑭示蹤分布、血清內(nèi)毒素水平,同時(shí)測(cè)定動(dòng)物腸道TLR4mRNA表達(dá)水平、NF-κB、Occudin蛋白含量及血清中炎癥介質(zhì)TNF-α、IL-6的濃度差異。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　1.

7、C組大鼠活躍,精神興奮,腹腔無(wú)肉眼可見(jiàn)炎癥反應(yīng)。H組及HL組大鼠活動(dòng)減少,精神明顯萎靡,腸管可見(jiàn)明顯腫脹,腸粘膜充血。HL組可見(jiàn)少量腹水及腸系膜淋巴結(jié)腫大。HP組及HPL組活動(dòng)減少,精神較萎靡,腸腔可見(jiàn)輕微腫脹,未見(jiàn)明顯粘膜充血。
　　2.與C組比較,H組和HL組腸外組織器官中檢測(cè)出腸源性細(xì)菌,腸道細(xì)菌移位率顯著增高,HL組增高更加明顯(P<0.05)。三組動(dòng)物血清LPS檢測(cè)結(jié)果與細(xì)菌移位情況一致。電鏡顯示,H組、HL組腸粘膜萎縮

8、、脫落,細(xì)胞器可見(jiàn)不同程度損傷,細(xì)胞間緊密連接間隙增寬,硝酸鑭示蹤可見(jiàn)La3+透過(guò)腸上皮和血管內(nèi)皮廣泛分布于上皮緊密連接、基底膜及血管外間質(zhì)。
　　3.采用PDTC干預(yù)后,HP組相對(duì)于H組、HPL組相對(duì)于HL組,細(xì)菌移位率顯著降低(P<0.05),血清LPS檢測(cè)結(jié)果與細(xì)菌移位情況一致。透射電鏡觀(guān)察顯示,HP組、HPL組分別較H組、HL組損傷明顯減輕,細(xì)胞器形態(tài)基本正常,僅局部可見(jiàn)硝酸鑭分布于細(xì)胞基底膜。
　　4.與對(duì)照組比較

9、,H組和HL組血清TNF-α、IL-6含量明顯升高(P<0.05),HP組、HPL組炎癥因子含量分別較H組、HL組降低(P<0.05)。熒光定量RT-PCR和Westernblot分別對(duì)TLR4mRNA、NF-κBp65表達(dá)量的檢測(cè)與血清因子結(jié)果一致(P<0.05)。而采用Westernblot對(duì)緊密連接蛋白Occludin的檢測(cè)結(jié)果與NF-κBp65結(jié)果呈相反趨勢(shì),H組、HL組降低,干預(yù)后HP組、HPL組顯著增高(P<0.05)。

10、r>　　實(shí)驗(yàn)結(jié)論：
　　1.采用低壓艙模擬7000米低壓性缺氧環(huán)境可有效建立實(shí)驗(yàn)性高原胃腸道損傷及細(xì)菌移位的動(dòng)物模型,為進(jìn)一步研究重癥高原病的發(fā)病機(jī)制提供基礎(chǔ)。
　　2.急性低氧暴露對(duì)大鼠空腸上皮超微結(jié)構(gòu)損傷嚴(yán)重,以腸道微絨毛、上皮細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞間緊密連接處明顯。細(xì)胞內(nèi)各細(xì)胞器亦有不同程度的損傷。
　　3.TLR4/NF-κB信號(hào)通路的激活參與了這一病理過(guò)程的發(fā)生發(fā)展,其機(jī)制涉及上皮超微結(jié)構(gòu)破壞、構(gòu)成緊密連接復(fù)合體