TLR4-NF-κB在低氧暴露下大鼠腸道屏障功能損傷及細(xì)菌移位中的作用研究.pdf

1、研究背景及意義：
　　急性重癥高原病(ASMS)是機(jī)體快速抵達(dá)高原后,由于低壓性缺氧導(dǎo)致組織臟器在短時間內(nèi)發(fā)生嚴(yán)重代謝功能及能量供應(yīng)障礙,并伴有明顯臨床表現(xiàn)的一組癥候群,主要包括高原肺水腫(HAPE)和高原腦水腫(HACE)。此類疾病發(fā)展迅猛、極易導(dǎo)致擴(kuò)大的炎癥反應(yīng)、死亡率高,嚴(yán)重危及急進(jìn)高原人群的健康。雖然目前針對肺和腦本身的研究較多,但關(guān)于其發(fā)病機(jī)制至今仍然存在較大爭議,研究陷入了瓶頸。而對于肺外及腦外機(jī)制,卻關(guān)注較少,這為我

2、們從另一方面研究ASMS的發(fā)病機(jī)理提供了一個新的切入點(diǎn)。
　　胃腸道作為人體重要的器官,同時也是人體最大的儲菌庫和內(nèi)毒素庫。正常情況下,腸道粘膜的各種生理性屏障可以保證致病因素不能越過屏障侵入腸道以外的地方,TLR4/NF-κB由于其在胃腸的高表達(dá)及其特異性配體LPS在腸道細(xì)菌的廣泛存在,引起我們的關(guān)注。腸道在遭受打擊或應(yīng)激狀態(tài)下,屏障完整性被破壞,腸道就成了各種毒素和病原微生物入侵機(jī)體的門戶,隨著多種炎癥介質(zhì)“瀑布樣”級聯(lián)活化效

3、應(yīng),可誘發(fā)全身炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS),進(jìn)而損傷遠(yuǎn)隔器官,形成“腸源性感染”。故目前多數(shù)學(xué)者認(rèn)為腸道在應(yīng)激時,是多器官功能障礙(MODS)的始動器官。毫無疑問,高原低壓性缺氧對機(jī)體是一種強(qiáng)烈的應(yīng)激。
　　國內(nèi)外已有的研究證實(shí),缺氧可能引起細(xì)菌的移位,而這種屏障的損傷、細(xì)菌的移位是通過何種機(jī)制,以及TLR4/NF-κB在其中是否發(fā)揮重要作用,尚未見報道?；谝陨媳尘?我們采用亞洲最大的低壓模擬艙群模擬高原環(huán)境,建立實(shí)驗性高原胃腸道

4、損傷大鼠模型,以此研究低氧暴露下腸道屏障功能損傷及細(xì)菌移位的作用機(jī)制,為深入理解重癥高原病的發(fā)病機(jī)理提供新的靶點(diǎn),有重要的臨床意義。
　　研究方法：
　　1.實(shí)驗性高原胃腸道損傷動物模型的建立:成年健康雄性SD大鼠60只,采用隨機(jī)數(shù)字法分為平原對照組(C)、單純?nèi)毖踅M(H),并根據(jù)高原特殊氣候環(huán)境及衛(wèi)生條件下機(jī)體胃腸道疾病易感性增加的特點(diǎn),加設(shè)了單純?nèi)毖?LPS處理組(HL),每組各20只。C組置于平原環(huán)境,H組和HL組飼養(yǎng)

5、于模擬海拔7000m處,溫度25℃,光暗周期24h,HL組按計劃給藥。三組均于72h后處死取材。通過檢測腸道細(xì)菌移位、腸粘膜超微結(jié)構(gòu)改變、血清內(nèi)毒素水平等情況,綜合判定動物模型。
　　2.TLR4/NF-κB在低氧暴露導(dǎo)致的大鼠腸道損傷中的機(jī)制探討:成年健康雄性SD大鼠100只,采用隨機(jī)數(shù)字法分為平原對照組(C)、單純?nèi)毖踅M(H)、缺氧+100mg/kg·bwPDTC組(HP)、缺氧+0.5mg/kg·bwLPS組(HL)、缺氧+

6、PDTC+LPS組(HPL),各組按既定方案給藥,并按上訴方法復(fù)制實(shí)驗性高原胃腸道損傷動物模型。減壓結(jié)束后(72h),平原組在平原環(huán)境取材,其余四組在模擬海拔4500m處取材。檢測各組動物腸外組織細(xì)菌移位情況、細(xì)菌生化鑒別、腸道粘膜超微結(jié)構(gòu)改變和硝酸鑭示蹤分布、血清內(nèi)毒素水平,同時測定動物腸道TLR4mRNA表達(dá)水平、NF-κB、Occudin蛋白含量及血清中炎癥介質(zhì)TNF-α、IL-6的濃度差異。
　　實(shí)驗結(jié)果：
　　1.

7、C組大鼠活躍,精神興奮,腹腔無肉眼可見炎癥反應(yīng)。H組及HL組大鼠活動減少,精神明顯萎靡,腸管可見明顯腫脹,腸粘膜充血。HL組可見少量腹水及腸系膜淋巴結(jié)腫大。HP組及HPL組活動減少,精神較萎靡,腸腔可見輕微腫脹,未見明顯粘膜充血。
　　2.與C組比較,H組和HL組腸外組織器官中檢測出腸源性細(xì)菌,腸道細(xì)菌移位率顯著增高,HL組增高更加明顯(P<0.05)。三組動物血清LPS檢測結(jié)果與細(xì)菌移位情況一致。電鏡顯示,H組、HL組腸粘膜萎縮

8、、脫落,細(xì)胞器可見不同程度損傷,細(xì)胞間緊密連接間隙增寬,硝酸鑭示蹤可見La3+透過腸上皮和血管內(nèi)皮廣泛分布于上皮緊密連接、基底膜及血管外間質(zhì)。
　　3.采用PDTC干預(yù)后,HP組相對于H組、HPL組相對于HL組,細(xì)菌移位率顯著降低(P<0.05),血清LPS檢測結(jié)果與細(xì)菌移位情況一致。透射電鏡觀察顯示,HP組、HPL組分別較H組、HL組損傷明顯減輕,細(xì)胞器形態(tài)基本正常,僅局部可見硝酸鑭分布于細(xì)胞基底膜。
　　4.與對照組比較

9、,H組和HL組血清TNF-α、IL-6含量明顯升高(P<0.05),HP組、HPL組炎癥因子含量分別較H組、HL組降低(P<0.05)。熒光定量RT-PCR和Westernblot分別對TLR4mRNA、NF-κBp65表達(dá)量的檢測與血清因子結(jié)果一致(P<0.05)。而采用Westernblot對緊密連接蛋白Occludin的檢測結(jié)果與NF-κBp65結(jié)果呈相反趨勢,H組、HL組降低,干預(yù)后HP組、HPL組顯著增高(P<0.05)。

10、r>　　實(shí)驗結(jié)論：
　　1.采用低壓艙模擬7000米低壓性缺氧環(huán)境可有效建立實(shí)驗性高原胃腸道損傷及細(xì)菌移位的動物模型,為進(jìn)一步研究重癥高原病的發(fā)病機(jī)制提供基礎(chǔ)。
　　2.急性低氧暴露對大鼠空腸上皮超微結(jié)構(gòu)損傷嚴(yán)重,以腸道微絨毛、上皮細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞間緊密連接處明顯。細(xì)胞內(nèi)各細(xì)胞器亦有不同程度的損傷。
　　3.TLR4/NF-κB信號通路的激活參與了這一病理過程的發(fā)生發(fā)展,其機(jī)制涉及上皮超微結(jié)構(gòu)破壞、構(gòu)成緊密連接復(fù)合體