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文檔簡(jiǎn)介
1、目的:2型糖尿病作為一種流行性疾病已經(jīng)成為重大的公共健康問(wèn)題,其慢性并發(fā)癥可廣泛累及肝、腎、心、肺、視網(wǎng)膜、血管、神經(jīng)系統(tǒng)、骨骼肌及皮膚等組織器官,其中糖尿病性肝臟病變主要表現(xiàn)為非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholicfatty liver disease,NAFLD)。NAFLD與2型糖尿病(Type2 diabetesmellitus,T2DM)擁有共同土壤即炎癥與胰島素抵抗(Insulin resistence,IR)[1]。
2、Toll樣受體4(Tolllike receptor4,TLR4)是主要的模式識(shí)別受體,除外源性配體外,還可與炎癥、組織損傷、應(yīng)激等相關(guān)的內(nèi)源性配體(danger-associated molecular patterns,DAMPS)結(jié)合[2],參與機(jī)體免疫應(yīng)答、炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激,在多種慢性炎癥和自身免疫性疾病的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中起到重要作用[3]。另外,鋅指蛋白A20是由炎癥反應(yīng)激活的重要調(diào)節(jié)蛋白,可抑制由TLR4介導(dǎo)的NF-κB的
3、活化,是TLR4/NF-κB信號(hào)通路重要的負(fù)反饋調(diào)節(jié)因子[4]。辛伐他汀是羥甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶抑制劑,可減少膽固醇及低密度脂蛋白形成[5],近來(lái)研究證實(shí)辛伐他汀具有調(diào)脂作用之外的抗炎、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)等作用,在多種慢性炎癥疾病中具有廣大應(yīng)用前景。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用高糖高脂飼料聯(lián)合小劑量鏈脲佐菌素(streptozocin,STZ)制備2型糖尿病大鼠模型,檢測(cè)其肝臟中TLR4的表達(dá)及辛伐他汀干預(yù)后的變化,以闡明辛伐他汀對(duì)糖尿病性肝臟病變的
4、保護(hù)作用及其機(jī)制,同時(shí)檢測(cè)鋅指蛋白A20在2型糖尿病大鼠肝臟組織中的表達(dá)并探討其作用機(jī)制。
方法:40只雄性清潔級(jí)Sprague-Dawley(SD)大鼠,鼠齡6周,體重為180g±20g。清潔實(shí)驗(yàn)室環(huán)境下予普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1周,后應(yīng)用隨機(jī)數(shù)字表法從40只SD大鼠中隨機(jī)抽取10只作為正常對(duì)照組(A組),余為實(shí)驗(yàn)組。對(duì)照組以普通飼料喂養(yǎng),實(shí)驗(yàn)組以高糖高脂飼料(普通飼料中加入20%白砂糖、2.5%膽固醇、15%熟豬油)[6]喂養(yǎng)
5、。實(shí)驗(yàn)組在高糖高脂飼料喂養(yǎng)4周后,一次性腹腔注射STZ30mg/kg。實(shí)驗(yàn)第6周末選取空腹血糖大于正常大鼠空腹血糖3個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差(即7.8mmol/L)且伴有胰島素敏感指數(shù)(Insulin Sensitivity Index,ISI)下降者即為2型糖尿病大鼠模型[7],共26只,將其隨機(jī)分為兩組,即單純2型糖尿病組(B組,13只),辛伐他汀干預(yù)組(C組,13只)。C組予20 mg/kg辛伐他汀[8]灌胃,每日給藥1次,連續(xù)灌胃8周,A組、B
6、組均予等體積生理鹽水灌胃。實(shí)驗(yàn)14周末1。心臟取血2 mL待測(cè)空腹血糖(fasting blood glucose,F(xiàn)BG)、谷氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(Glutamate aminotransferase,ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(Aspartateaminotransferase,AST)、高密度脂蛋白膽固醇(High density lipoproteincholesterol,HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(Low density
7、 lipoproteincholesterol,LDL-C)、甘油三酯(Triglyceride,TG)、總膽固醇(Cholesterol,TC)等生化指標(biāo)。2.取部分肝組織置于液氮中保存,采用RT-PCR法檢測(cè)TLR4 mRNA的表達(dá)水平;另取一肝葉予4%多聚甲醛固定,待HE染色觀察肝臟形態(tài)學(xué)變化,免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)TLR4、A20的蛋白表達(dá),且應(yīng)用免疫組化圖像分析系統(tǒng)計(jì)算其免疫組化評(píng)分即IHS[9]。使用spss13.0統(tǒng)計(jì)軟件處
8、理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),三組數(shù)據(jù)均進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)、方差分析,正態(tài)分布資料以(x±s)表示,偏態(tài)分布資料以四分位數(shù)法表示多組比較采用單因素方差分析(ANOVA),組間比較應(yīng)用SNK檢驗(yàn)。相關(guān)性分析采用直線相關(guān)分析法,均以P<0.05確定為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
結(jié)果:
1實(shí)驗(yàn)6周末實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)
實(shí)驗(yàn)組FBG為12.02±2.7mmol/L明顯高于對(duì)照組的6.16±0.38 mmol/L(P<0.05);對(duì)照組空腹胰島素(Fastin
9、g insulin,F(xiàn)INS)為17.82(17.46,18.02)mIU/L與實(shí)驗(yàn)組19.02(18.68,19.15)mIU/L比較差異無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);實(shí)驗(yàn)組ISI0.0046(0.0038,0.0052)低于對(duì)照組0.0094(0.0088,0.0095),差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。(Table1)
2實(shí)驗(yàn)14周末實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)
血糖:
B組FBG為12.37±3.0 mmol/L
10、、C組FBG為11.50±2.0 mmol/L,均明顯高于A組的5.72±0.43 mmol/L,差別均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),比較B組、C組的FBG無(wú)明顯差異(P>0.05)。
肝功、血脂:
A組:ALT53.25±5.20 U/L、AST184.25±12.5 U/L、HDL-C0.71±0.25 mmol/L、LDL-C1.23±0.16 mmol/L、TG0.78±0.45 mmol/L、TC2.40±
11、0.21 mmol/L
B組:ALT84.4±6.8 U/L、AST221±16.30 U/L、HDL-C0.53±0.15 mmol/L、LDL-C2.12±0.10 mmol/L、TG1.81±0.24 mmol/L、TC5.50±0.82 mmol/L
C組:ALT60.3±10.5 U/L、AST207±14.8 U/L、HDL-C0.67±0.08 mmol/L、LDL-C1.63±0.04 mmol/L、
12、TG1.06±0.31mmol/L、TC2.93±0.42 mmol/L
結(jié)果示B、C兩組的ALT、TG、TC、LDL-C水平明顯高于A組,C組水平低于B組,差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),三組AST、HDL-C比較差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。(Table2、3)
3肝臟病理改變
3.1肉眼觀察:A組大鼠肝臟呈紅褐色,顏色鮮亮,有光澤,肝葉邊緣銳利。B組、C組肉眼觀察無(wú)明顯差異均表現(xiàn)為:肝臟體積明顯增大,顏色多為淺
13、灰色或褐色,無(wú)光澤,邊緣圓鈍。
3.2 HE染色:A組大鼠肝細(xì)胞排列規(guī)則,以中央靜脈為中心呈規(guī)則放射狀排列,肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰,胞核居中,胞質(zhì)清晰,偶見(jiàn)炎細(xì)胞。B組肝細(xì)胞排列結(jié)構(gòu)紊亂,肝細(xì)胞體積明顯增大、變圓,胞內(nèi)含大小不一的脂滴,胞核偏向,甚至擠到細(xì)胞一側(cè)呈現(xiàn)印戒細(xì)胞,肝小葉內(nèi)現(xiàn)炎細(xì)胞浸潤(rùn),C組雖然也有肝細(xì)胞脂肪樣變性、排列紊亂、炎細(xì)胞浸潤(rùn)等情況,但是較B組明顯減輕。(Fig.14-16)
4 TLR4與鋅指蛋白A20
14、蛋白表達(dá)情況
4.1 TLR4
TLR4蛋白表達(dá)主要表現(xiàn)為胞質(zhì)內(nèi)的棕黃色顆粒沉著,A組大鼠肝臟有少量表達(dá),呈淺黃色;B組大鼠肝臟TLR4的含量明顯高于A組,深黃;C組大鼠其表達(dá)較B組明顯減少,但仍多于A組。免疫組化圖像分析結(jié)果示A組IHS為2.4±1.14;B組IHS為8.3±0.82;C組IHS為5.6±1.8。B組IHS是A組的3.5倍,C組是B組的67.42%,差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)(Table4
15、,F(xiàn)ig.8-10)。相關(guān)分析表明,大鼠肝臟TLR4的表達(dá)與ALT呈正相關(guān)(r=0.87,p<0.05)
4.2鋅指蛋白A20
A20蛋白表達(dá)以胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒來(lái)判斷,免疫組化結(jié)果IHS:A組1.8±0.83;B組7.4±1.3;C組4.6±1.6,B組是A組的4.1倍,C組是B組62.16%,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。(Table4,F(xiàn)ig.11-13)
5 TLR4 mRNA表達(dá)
16、r> TLR4 mRNA表達(dá)結(jié)果以rTLR4表示(rTLR4=TLR4 OD值/β-actin OD值),A組大鼠肝組織TLR4 mRNA表達(dá)較弱(rTLR4為0.31±0.05),B組大鼠肝組織TLR4 mRNA的表達(dá)(rTLR4為1.07±0.23)是A組的3.4倍,而C組(rTLR4為0.78±0.35)是B組72.8%,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。(Table5,F(xiàn)ig.7)
結(jié)論:
1 TLR4可
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