潰瘍性結(jié)腸炎分子標(biāo)志物的篩查和發(fā)病機(jī)制的初步探討.pdf

1、背景、目的:潰瘍性結(jié)腸炎(UC)是炎癥性腸病(IBD)的一個(gè)主要類型，是一種原因不明的慢性非特異性腸道炎癥1。病變主要限于結(jié)腸的黏膜層和粘膜下層，以潰瘍和隱窩膿腫為主要特點(diǎn)，多累及直腸和乙狀結(jié)腸，也可遍及整個(gè)結(jié)腸2。臨床表現(xiàn)主要是腹瀉、粘液膿血便、腹痛。病情輕重不等，多呈反復(fù)發(fā)作的慢性病程3,4。本病可以發(fā)生在任何年齡，多見(jiàn)于20-40歲5，亦可見(jiàn)于兒童或老年。男女發(fā)病率無(wú)顯著差別。病理特點(diǎn)是粘膜的彌漫性炎癥，固有膜內(nèi)彌漫性淋巴細(xì)胞、漿

2、細(xì)胞、單核細(xì)胞等炎細(xì)胞浸潤(rùn)，活動(dòng)期有大量中性粒細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，可發(fā)生隱窩炎和隱窩膿腫。上世紀(jì)六十年代英國(guó)科學(xué)家Morson從病理學(xué)特征上將它與克羅恩病(CD)加以區(qū)分并將其界定為獨(dú)立的疾病。該病在歐美國(guó)家較常見(jiàn)，歐洲20個(gè)中心調(diào)查顯示UC的年發(fā)病率為11.2/10萬(wàn)，以往發(fā)病率較低的東方國(guó)家，近年也呈現(xiàn)增高趨勢(shì)。我國(guó)1981-2000年間共計(jì)報(bào)道UC病例10218，近10年該病報(bào)道數(shù)上升3.1倍6。我國(guó)目前暫缺乏大規(guī)模的流行病學(xué)

3、調(diào)查，但粗略估計(jì)UC發(fā)病率為11.6/10萬(wàn)7，而且有證據(jù)表明成逐年上升趨勢(shì)8-10。而且，潰瘍性結(jié)腸炎是一種癌前病變11，與結(jié)腸癌的發(fā)病有關(guān)12，且病程長(zhǎng)，病變程度輕重各異，由于病因不明，臨床上常常表現(xiàn)反復(fù)發(fā)作而治愈難度大13，14，被世界衛(wèi)生組織列為現(xiàn)代難治病之一15。要達(dá)到UC治愈的目的，早期發(fā)現(xiàn)及發(fā)病機(jī)制的研究至關(guān)重要16。
　　 盡管深入到分子生物學(xué)、基因水平甚至蛋白水平的研究方法，使得潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)病機(jī)制的研究取得

4、了突飛猛進(jìn)的發(fā)展;必須明確潰瘍性結(jié)腸炎是多因素參與的復(fù)雜疾病，單基因或蛋白質(zhì)標(biāo)記物無(wú)法全面而準(zhǔn)確地反映其復(fù)雜的發(fā)病機(jī)制。因此需要運(yùn)用基因組、轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組等高通量技術(shù)來(lái)尋找由多基因或蛋白質(zhì)組成的復(fù)合型標(biāo)記物，以期更準(zhǔn)確、敏感地預(yù)測(cè)疾病，并深入闡釋其發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制。都知道基因組水平的研究，主要集中在微衛(wèi)星不穩(wěn)定性和基因的擴(kuò)增、缺失，轉(zhuǎn)錄組的研究重點(diǎn)是在mRNA水平檢測(cè)基因的表達(dá)變化，可以高通量地檢測(cè)組織或細(xì)胞樣本中全基因的mRNA水

5、平，建立基因表達(dá)譜，從而確定一組表達(dá)量與疾病相關(guān)的基因(Gene signature)，用于疾病預(yù)測(cè)和預(yù)后評(píng)估。與基因組水平的研究相比，Gene signature更具實(shí)用性。而蛋白質(zhì)組則不僅研究基因的蛋白產(chǎn)物豐度，還注重檢測(cè)蛋白質(zhì)翻譯后修飾及其對(duì)蛋白功能的影響。這三個(gè)層次的研究并不孤立，都反映了差異基因的豐度和表達(dá)變化，三個(gè)層次的研究結(jié)果可以相互印證，互為補(bǔ)充。
　　 前期首先運(yùn)用雙向電泳和質(zhì)譜技術(shù)，比較12例潰瘍性結(jié)腸炎和1

6、2例正常組織的蛋白質(zhì)表達(dá)譜，從中鑒定出30種差異表達(dá)蛋白質(zhì)。進(jìn)一步利用生物信息學(xué)方法，找到11種與P38MAPK通路相關(guān)的差異表達(dá)蛋白質(zhì)，并將這11種蛋白與該通路的關(guān)鍵蛋白質(zhì)組成一個(gè)差異蛋白質(zhì)簇。用Western Blot技術(shù)在上述樣本中初步驗(yàn)證了此差異蛋白質(zhì)簇與潰瘍性結(jié)腸炎的相關(guān)性。然后從該蛋白質(zhì)簇中選取了兩種蛋白，Galectin-3和MAWBP，用免疫組化技術(shù)在56例潰瘍性結(jié)腸炎和正常樣本中檢測(cè)其豐度。發(fā)現(xiàn)Galectin-3和M

7、AWBP在潰瘍性結(jié)腸炎組織中表達(dá)顯著降低(x2=31.404，P=0.000;x2=20.541，P=0.000)，并與炎癥程度特異相關(guān)(x2=12.315，P=0.002; x2=8.726，P=0.018)。
　　 本研究中，擬在前期試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探討P38MAPK與潰瘍性結(jié)腸炎的相關(guān)性和調(diào)控機(jī)制，并進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量研究差異蛋白簇中抽提出的蛋白質(zhì)印記作為潰瘍性結(jié)腸炎分子標(biāo)志物的可能性。針對(duì)此蛋白印跡中的一種與潰瘍性

8、結(jié)腸炎密切相關(guān)的新蛋白MAWBP，對(duì)此產(chǎn)生了濃厚的興趣，利用基因組學(xué)和多種分子生物學(xué)技術(shù)結(jié)合對(duì)其生物學(xué)功能及與潰瘍性結(jié)腸炎的關(guān)系進(jìn)行了研究。還進(jìn)一步利用基因組學(xué)分析了潰瘍性結(jié)腸炎反復(fù)遷延不愈的復(fù)雜機(jī)制，找到了重要的腫瘤相關(guān)基因，從而為潰瘍性結(jié)腸炎癌前病變提供了候選標(biāo)志物及有希望的新治療靶點(diǎn)。
　　 方法:
　　 1、運(yùn)用Westem Blot和ELISA技術(shù)，在巨噬細(xì)胞系RAW264.7中驗(yàn)證前期蛋白組學(xué)得到的差異蛋白簇

9、受P38MAPK信號(hào)通路的調(diào)控，用免疫組化技術(shù)檢測(cè)118例樣本中差異蛋白簇磷酸化P38、Galectin-3和MAWBP的表達(dá)并分析其與潰瘍性結(jié)腸炎臨床特點(diǎn)的相關(guān)性和作為復(fù)合標(biāo)志物的可能性。
　　 2、運(yùn)用Microarray和多種分子生物學(xué)方法揭示差異蛋白MAWBP在潰瘍性結(jié)腸炎中的作用、功能和分子機(jī)制。首先通過(guò)免疫組化和Western Blot檢測(cè)MAWBP結(jié)合蛋白MAWD在潰瘍性結(jié)腸炎中的表達(dá)和定位，進(jìn)而通過(guò)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)

10、確定兩者相互結(jié)合。通過(guò)構(gòu)建真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染Caco-2細(xì)胞來(lái)分別及共同高表達(dá)MAWBP和MAWD，Microarray技術(shù)分析其基因表達(dá)譜，進(jìn)而通過(guò)Real-time PCR和Western Blot驗(yàn)證差異基因。最后通過(guò)干擾RNA技術(shù)敲低MAWBP和MAWD的表達(dá)，進(jìn)一步從反方向驗(yàn)證MAWBP和MAWD與ERK通路的關(guān)系。
　　 3、運(yùn)用DASL技術(shù)在轉(zhuǎn)錄水平對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎活動(dòng)期和靜止期的基因表達(dá)譜進(jìn)行分析，挑選同一病人同一部

11、位的活動(dòng)期和靜止期內(nèi)鏡下標(biāo)本共29例，對(duì)差異基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析，進(jìn)一步通過(guò)Real-time PCR和免疫組織化學(xué)染色方法驗(yàn)證差異基因的表達(dá)。
　　 4、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:用SPSS13.0軟件來(lái)進(jìn)行所有的數(shù)據(jù)分析;Pearsonchi-square檢驗(yàn)和Fisher's確切概率法來(lái)分析蛋白質(zhì)表達(dá)與疾病病理特征之間的關(guān)系;方差分析及后續(xù)的基于方差分析的多重比較方法來(lái)分析Real-time PCR結(jié)果和基因組學(xué)差異基因結(jié)果;P＜0.

12、05被認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;結(jié)果的相關(guān)性用Pearson相關(guān)性檢驗(yàn)，r＞0.5為強(qiáng)相關(guān)。
　　 結(jié)果
　　 1、用Western Blot技術(shù)驗(yàn)證了與P38MAPK通路相關(guān)的差異蛋白質(zhì)簇與潰瘍性結(jié)腸炎的相關(guān)性。細(xì)胞水平進(jìn)一步驗(yàn)證了差異蛋白簇受P38MAPK通路的調(diào)控。然后從該蛋白質(zhì)簇中選取了三種可以指示P38MAPK通路活化狀態(tài)的蛋白，磷酸化P38，Galectin-3和MAWBP，免疫組化結(jié)果顯示這三種蛋白質(zhì)與潰瘍性結(jié)

13、腸炎特異相關(guān)(x2=41.509，P＜0.001; x2=62.668，P＜0.001; x2=68.997，P＜0.001)，其組成的蛋白質(zhì)印記以高敏感性(94.83％)和特異性(98.33％)可以對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎進(jìn)行正確判定，這種蛋白質(zhì)印記是一種評(píng)估潰瘍性結(jié)腸炎炎癥程度的復(fù)合標(biāo)志物。
　　 2、生物信息學(xué)分析顯示MAWBP為MAWD的結(jié)合蛋白，免疫組化和WesternBlot結(jié)果顯示MAWD同MAWBP一樣也在潰瘍性結(jié)腸炎組織

14、中表達(dá)降低。免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)顯示了兩種蛋白可以相互結(jié)合形成復(fù)合物。Real-time PCR和WesternBlot結(jié)果顯示MAWBP和MAWD真核表達(dá)載體成功轉(zhuǎn)染入Caco-2細(xì)胞。對(duì)Microarray結(jié)果進(jìn)行生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)MAWBP和MAWD可導(dǎo)致ERK1通路活化，癌基因TPX2被激活高表達(dá)，而炎癥因子和趨化因子能夠被抑制。Real-timePCR驗(yàn)證了炎癥因子IL8、TSC1、CXCL2和IFIT1及癌基因TPX2的表達(dá)。Mi

15、croarray和Real-time PCR結(jié)果強(qiáng)相關(guān)。Western Blot驗(yàn)證了MAWBP和MAWD高表達(dá)能夠激活ERK通路，以及干擾RNA敲低MAWBP和MAWD的表達(dá)后能夠抑制ERK通路。
　　 3、運(yùn)用DASL對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎活動(dòng)期和靜止期的基因表達(dá)譜進(jìn)行分析，共發(fā)現(xiàn)上調(diào)基因909個(gè)，下調(diào)基因823個(gè)，其中上調(diào)組基因主要涉及了炎癥反應(yīng)、結(jié)直腸腫瘤癌基因和EMT，下調(diào)組基因主要涉及了結(jié)直腸腫瘤抑癌基因和PPAR通路。通過(guò)

16、Real-time PCR驗(yàn)證了結(jié)直腸腫瘤相關(guān)癌基因MMP1、MMP3、CHI3L1和CHRDL2，抑癌基因ABCG2和PLA2G12B在UC活動(dòng)期中有顯著的差異表達(dá)，進(jìn)一步通過(guò)免疫組化檢測(cè)發(fā)現(xiàn)MMP1、CHI3L1和ABCG2在潰瘍性結(jié)腸炎、結(jié)腸癌和正常組織三組之間的表達(dá)均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(x2=8.418，P=0.015; x2=6.995，P=0.030; x2=6.285，P=0.043)，提示了UC的高癌變風(fēng)險(xiǎn)。結(jié)合蛋白組學(xué)及We

17、stem Blot、Real-time PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)間質(zhì)標(biāo)志物Vimentin在UC中升高，上皮標(biāo)志物E-cadherin在UC中減低。
　　 結(jié)論
　　 1、運(yùn)用整合蛋白組學(xué)得到一個(gè)由三種差異蛋白組成的蛋白質(zhì)印記，磷酸化P38，Galectin-3和MAWBP，是一種評(píng)估潰瘍性結(jié)腸炎炎癥程度的復(fù)合標(biāo)志物。
　　 2、運(yùn)用整合基因組學(xué)發(fā)現(xiàn)MAWBP及其結(jié)合蛋白MAWD可激活ERK通路、活化癌基因TPX2，并在潰