病毒及質(zhì)粒DNA刺激后小鼠細胞內(nèi)IFn-β與Pd-L1的表達情況.pdf

1、目的:疫苗接種用于傳染性疾病的防控已取得了很大的成績。經(jīng)典的疫苗包括減毒活疫苗、滅活疫苗、類毒素和亞單位疫苗。這些疫苗的成功開發(fā)使得許多傳染病得到了有效的控制、預(yù)防及治療。但傳統(tǒng)疫苗有缺陷，例如死疫苗滅活不全和活疫苗毒力恢復(fù)等缺點，所以人們更希望能夠研制出安全、廉價、含有多種具有保護作用的免疫原，基因疫苗的應(yīng)運而生為這種疫苗的開發(fā)提供了可能性。
　　 基因疫苗具有多方面的優(yōu)點，比如既可以誘導(dǎo)體液免疫應(yīng)答又可以誘導(dǎo)細胞免疫應(yīng)答;沒

2、有死疫苗滅活不全和活疫苗毒力恢復(fù)的風(fēng)險;可編碼多種抗原，從而構(gòu)成多價疫苗;沒有亞單位疫苗因蛋白純化不夠誘發(fā)異源性免疫應(yīng)答的風(fēng)險并且具有設(shè)計簡單、制備容易、花費較低、相對穩(wěn)定等等優(yōu)點，同時還有研究表明，基因疫苗不僅可以預(yù)防某些傳染病，還可以作為一些治療性疫苗來治療一些復(fù)雜難治的疾病，例如病毒性肝炎等。這些優(yōu)點充分的顯示出基因疫苗巨大的潛力和應(yīng)用價值。但是自從90年代基因疫苗誕生以來至今尚無臨床可用的DNA疫苗可用于疾病的防治，究其原因是D

3、NA疫苗存在免疫保護作用不強的缺點。
　　 為克服DNA疫苗免疫保護差的弱點，我室和國內(nèi)外眾多研究者采用了多種措施。例如采用不同的接種方式以提高宿主細胞的轉(zhuǎn)染率;采用調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件以優(yōu)化質(zhì)粒的方法提高抗原的表達;通過在DNA疫苗接種的同時接種含有編碼樹突狀細胞特異性生長因子FLT31、GM-CSF等的質(zhì)粒的方法以求增加局部的抗原提高細胞聚集以提高抗原提呈作用;為了提高其免疫保護作用，而采用了使用不同的載體的方法。但均未達到預(yù)期

4、效果。
　　 肌肉注射是DNA疫苗的常用接種方式，但對有關(guān)肌細胞在DNA疫苗接種后所誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答過程中作用的清楚了解，有可能為DNA疫苗免疫效果的提高找出新的解決途徑。肌細胞在不同的生理和病理狀態(tài)下可表達多種細胞因子，趨化因子和免疫粘附分子等與免疫應(yīng)答相關(guān)的分子，其中干擾素是一組具有多種功能的活性蛋白質(zhì)（主要是糖蛋白），是可由多種體細胞和淋巴細胞產(chǎn)生的細胞因子，在同種細胞上具有廣譜的抗病毒、影響細胞生長，以及分化、調(diào)節(jié)免疫功能

5、等多種生物活性。而PD-L1具有負性調(diào)節(jié)作用，可能在質(zhì)粒DNA疫苗作用中使其保護不強起不到免疫的作用。
　　 基于上述考量，本研究以小鼠NOR-10細胞為研究對象，用質(zhì)粒以及病毒刺激細胞，以觀察小鼠肌細胞內(nèi)IFN-β及PD-L1的變化情況，以探討其在基因疫苗免疫中的作用及意義。
　　 方法:(1)體外刺激細胞:NOR-10細胞以2×105的密度鋪入到6孔板中，24小時后，用LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染PCD

6、NA3.0/VP1以及用重組腺病毒（AD/VP1本科室構(gòu)建）感染細胞，未處理細胞加新鮮培養(yǎng)基作為正常對照組。(2)Trizol提取細胞總RNA:細胞經(jīng)不同處理細胞后，分別在3小時、6小時、12小時、24小時、48小時、72小時后提取細胞總RNA，未處理組作為正常細胞對照組，進行RealTimePCR。(3)上述轉(zhuǎn)染后以及病毒感染后分別收取3小時、6小時、12小時、24小時、48小時、72小時的上清培養(yǎng)基做IFN-β的ELISA實驗。

7、r>　　 結(jié)果:(1)用PCDNA3.0/VP1刺激后，RealTimePCR的結(jié)果顯示PD-L1的mRNA表達在3小時的時候達到高峰，6小時、12小時、24小時、48小時開始緩慢下降，72小時又達到一個高峰;IFN-β的mRNA表達在3小時、6小時持續(xù)性升高，在12小時達到高峰，24小時、48小時下降，72小時又達到一個高峰;ELISA實驗結(jié)果顯示，IFN-β的蛋白表達在6小時開始升高，12小時、24小時達到高峰，48小時開始下降，

8、72小時接近正常水平。(2)用腺病毒感染細胞后，RealTimePCR的結(jié)果顯示PD-L1的mRNA表達在3小時、6小時、12小時持續(xù)性升高，在24小時達到高峰，48小時略有下降，72小時達到最高峰;IFN-β的mRNA表達在3小時、6小時、12小時呈現(xiàn)表達抑制，24小時表達較正常細胞略微升高，72小時達到最高;ELISA實驗結(jié)果顯示，IFN-β的蛋白表達在3小時、6小時、12小時接近正常細胞水平，24小時開始升高，72小時達到最高峰。