牛Ⅰ型干擾素家族新成員(IFN-ε、IFN-κ、IFN-χ)抗病毒信號轉導與表達調控研究.pdf

1、干擾素(interferons，IFN)是見于所有有頜類脊椎動物的一大類多效應細胞因子，主要擔負宿主抗病毒感染免疫應答功能，不同的病原感染往往傾向于誘導表達出特定的干擾素成員，發(fā)現(xiàn)并系統(tǒng)鑒定干擾素新成員對抗病毒感染免疫應答具有重要的意義。固有免疫是機體抵御病原入侵的第一道防線，抗病毒固有免疫反應起始于細胞內(nèi)模式識別受體(PRRs)。PRRs識別的病原相關分子模式(PAMPs)通過轉錄因子NF-κB和干擾素調節(jié)因子(IRF)（尤其是IRF

2、3和IRF7）來進一步誘導Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生，建立抗病毒狀態(tài)以促進適應性免疫應答，最終從機體內(nèi)清除病毒感染，所以Ⅰ型干擾素在建立抗病毒感染狀態(tài)和宿主細胞抵抗病毒復制方面具有重要的作用。
　　本研究首先系統(tǒng)分析了牛Ⅰ型干擾素基因座位，定位到牛的2個干擾素新亞型(IFN-ε、IFN-κ)以及1個包含有2個成員的新亞族（IFN-x1、IFN-x3），隨后圍繞這四種干擾素的抗病毒信號轉導與表達調控進行了一系列的研究，具體研究內(nèi)容如下:

3、>　　1.牛Ⅰ型干擾素基因座圖譜的構建與分析。綜合運用多種在線BLAST方法(BLAST，Basic Local Alignment Search Tool，基本的基于局部比對的搜索工具)對牛全基因組篩選，全面分析各型干擾素的信息，發(fā)現(xiàn)牛Ⅰ型干擾素基因排布于8號染色體上，并進化出了具有鮮明特征的干擾素新家族，其中最為引人注目當屬IFN-x亞族。IFN-x亞族具有4個成員，具備全新干擾素的特征，組成了1個新干擾素亞族。牛Ⅰ型干擾素基因座按

4、轉錄方向分成2個大的亞座位，長度(746kp)分別是人(403kp)和鼠(323kb)的1.85和2.31倍，并且干擾素基因數(shù)目(64個)也遠超人（17個）與鼠（19個）。在座位末端5個IFN-δ假基因與4個IFN-x樣分子混雜在12個IFN-β樣基因之中，并且這些基因的轉錄方向均相同;基因座其它區(qū)域則被數(shù)量龐大的IFN-α（13個）和IFN-ω（24個）家族所占據(jù)。IFN-κ和IFN-ε僅存在1個拷貝序列，位于基因組的起始端，且IFN

5、-κ的轉錄方向與IFN-β相反，其與最近的干擾素基因間隔6.561Mb。
　　2.牛IFN-ε、IFN-κ、IFN-x1、IFN-x3的特性和抗病毒信號轉導通路。本研究首先從牛肝基因組中克隆得到了牛IFN-ε、IFN-κ、IFN-x1、IFN-x3基因，并分析了這些序列的特征。隨后在大腸桿菌表達系統(tǒng)表達了重組牛IFN-ε、IFN-κ、IFN-x1、IFN-x3的成熟肽序列，并制備了抗牛IFN-ε、IFN-κ、IFN-x多克隆抗體，

6、在不同的系統(tǒng)上測定了其抗病毒活性。牛IFN-ε、IFN-κ、IFN-x1、IFN-x3均對胰酶敏感，一定程度上耐熱（42℃和60℃）耐酸堿(pH2.0和pH10.0)，其抗病毒活性可被特異性多克隆抗體中和，也可被Ⅰ型干擾素受體IFNAR1和IFNAR2抗體阻斷。進一步研究發(fā)現(xiàn)牛IFN-ε、IFN-κ、IFN-x1、IFN-x3不僅可誘導干擾素刺激基因(ISGs，如Mx1，ISG15，ISG56)的轉錄，也可誘導Mx1，STAT1，NF-

7、κB p65的表達，這些分析表明目前已知的Ⅰ型干擾素成員均依賴JAK-STAT信號通路轉導抗病毒信號。
　　3.牛IFN-ε、IFN-κ、IFN-x1、IFN-x3對干擾素信號通路的影響。本試驗采用轉錄組測序的方式分析了在牛睪丸原代細胞上牛IFN-αA和IFN-x1的調控基因并比較了這些基因的表達差異，結果發(fā)現(xiàn)牛BoIFN-x1樣品處理組有40個差異基因表達上調;BoIFN-αA樣品處理組有80個差異基因表達上調，1個基因表達下調

8、。隨后采用熒光定量PCR進一步驗證了這些調控基因的在牛源細胞上的表達調控，結果顯示上調基因大部分屬于ISGs基因，隨機選取OAS、Mx1，STAT1、LGP2、GBP4、BST2、PML基因在MDBK、BT、BL細胞上進行驗證，證實這些基因在不同細胞上均有不同程度的上調。此外，牛Ⅰ型干擾素可在BL和BT細胞上啟動商品化的人NF-κB-Luc和ISRE-Luc報告載體的熒光素酶活性，并可激活本研究構建的BoIFNβ-Luc和BoIFNx-

9、Luc啟動子報告載體的熒光素酶活性，為進一步開展牛固有免疫信號通路的研究奠定了基礎。
　　4.牛干擾素信號通路相關分子的研究。維甲酸誘導基因(RIG-Ⅰ)、黑素瘤分化相關因子5(MDA5)是胞內(nèi)識別dsRNA的重要模式識別受體，IRF3和IRF7是參與固有免疫應答的重要轉錄因子，轉錄因子IRF9參與誘導Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生，ELF4、MAVS、MITA作為信號通路中的接頭分子參與誘導Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生。本研究運用RT-PCR的方法從犢牛

10、原代腎細胞中克隆獲得了牛接頭分子ELF4、MAVS、MITA的cDNA，并分析了其序列特征，組織表達和細胞器定位，重點研究了其對干擾素信號通路的影響。研究表明在不同的細胞上接頭分子ELF4、MAVS、MITA能誘導產(chǎn)生不同的Ⅰ型干擾素，促進信號通路相關分子的轉錄與表達，還能刺激ISRE、NF-κB、BoIFN-β和BoIFN-x啟動子激活的熒光素酶活性，為今后進一步探討接頭分子ELF4、MAVS、MITA在牛感染性疾病中的作用奠定了基礎

11、。
　　除了接頭分子ELF4、MAVS、MITA基因外，本研究還相繼克隆得到了牛干擾素信號通路中的重要分子MDA5、IRF3、IRF7、IRF9、DAI，這為今后研究牛固有免疫奠定基礎，同時也為研究牛病原與宿主相互作用提供便利工具。
　　5.3Cpro、Lbpro在牛源細胞上對干擾素信號通路的影響。首先分析了不同刺激物在不同細胞上對Ⅰ型干擾素及信號通路相關分子轉錄的影響，結合已有的研究證實FMDV可以拮抗宿主Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生

12、，F(xiàn)MDV的3Cpro和Lpro可以作用在不同的靶分子上來逃避宿主的固有免疫應答，拮抗Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生，本研究進一步發(fā)現(xiàn)3Cpro和Lpro不但能抑制Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生，抑制接頭分子ELF4、MAVS，RIG-Ⅰ樣受體RIG-Ⅰ、MDA5，轉錄因子IRF3、IRF7的轉錄，還能抑制Ⅰ型干擾素和接頭分子ELF4、MAVS、MITA激活的NF-κB、ISRE、BoIFN-β、BoIFN-x啟動子活性。Western Blot結果證實在BT和M

13、DBK細胞上3Cpro和Lpro可以抑制poly(I∶C)和BoIFN-β誘導的NF-κB p65、Mx1、IRF3、IRF7、ELF4、MAVS的表達。
　　總之，本研究系統(tǒng)分析了牛Ⅰ型干擾素新成員IFN-ε、IFN-κ、IFN-x的分子特征和生物學功能，初步建立了牛固有免疫信號通路研究的技術平臺，利用該平臺重點分析了接頭分子ELF4、MAVS、MITA對干擾素信號通路的影響，系統(tǒng)地分析了口蹄疫病毒3Cpro、Lbpro逃避固有